способ диагностики хронического гепатита у детей

Формула изобретения

Способ диагностики хронического гепатита у детей путем исследования клеток, отличающийся тем, что путем забора крови из вены получают препарат мононуклеарных фагоцитов, инкубируют с зимозаном, окрашивают по Романовскому, по показателю фагоцитарного индекса (% клеток, захвативших зимозан) определяют функциональное состояние клеток мононуклеарной фагоцитирующей системы и при снижении показателя фагоцитарного индекса до 55 2,3% диагностируют хронический персистирующий гепатит, а при снижении его до 24,2 9,9% с накоплением "неактивных" форм клеток - хронический активный гепатит.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине (педиатрии), патологии клетчатого иммунитета, к диагностике хронического гепатита у детей гистохимическим методом, позволяющим установить тяжесть процесса и контролировать его динамику на фоне лечения.

Уровень техники.

А. Известный способ (1 аналог), позволяющий с помощью клинического симптомокомплекса проследить за динамикой болезни (Малаховский Ю.Е. в кн. "Болезни печени и желчевыводящих путей у детей"/ Под. ред. Н.И.Нисевич, -Л.: "Медицина", 1981 , с. 249 - 271; Гользанд И.В. в кн. "Успехи гепатологии", Рига, 1977, вып. 6, с. 245 - 256, гл. "Течение хронического гепатита у детей").

Из субъективных симптомов учитываются жалобы диспептического, астеновегетативного характера, а у некоторых больных отмечают периодически возникающий абдоминальный синдром. Жалобы на снижение аппетита, тошноту, отрыжку, дисфункцию кишечника, общую слабость, быструю утомляемость, раздражительность, потливость, головную боль, боли в области эпигастрия и в правом подреберье. Однако у детей младшего возраста эти жалобы редко выделяются.

Из объективных симптомов хронического гепатита ведущими являются гепатомегалия или гепатоспленомегалия, которые более характерны для случаев хронического гепатита, протекающих с выраженной активностью, либо при агрессивном процессе. В случае же слабой или умеренно выраженной активности гепатитного процесса этот симптом у старших детей может быть выраженным минимально. Аналогично оценивается частота встречаемости желтухи, гемморагического синдрома, которые выявляются при более агрессивных формах хронического гепатита и не выявляются при молоактивных формах болезни.

Критика аналога.

Учитывая широкое разнообразие и вариабельность клинических проявлений и их индивидуальность при хроническом гепатите, следует отметить возможность субъективизма врача в оценке врачом клинических симптомов, что является недостатком известного способа, исключаемого заявленным способом.

Б. Известен способ (2 аналог) биохимических функциональных проб, который широко используется при обследовании больных хроническим гепатитом (см. Тодоров Й. "Клинические лабораторные исследования в педиатрии". София, 1966; Предтеченский В.К. "Руководство по клиническим и лабораторным исследованиям", Медгиз, 1960). В нем используются такие методы, как: модернизированный метод количественного определения содержания связанного билирубина; метод определения активности аминотрансфераз в сыворотке крови; метод определения общего белка и белковых фракций, определения протромбинового индекса, -липопротеидов и холестерина. Однако изменения указанных биохимических показателей функционального состояния печени наиболее информативными оказываются лишь в вариантах выраженной активности гепатитного процесса, особенно при развитии печеночно-клеточной недостаточности. В случаях же хронического гепатита, протекающих с малой или умеренной активностью, а также в периоде ремиссии, эти показатели изменяются незначительно либо сохраняются в пределах нормы.

Критика аналога.

К недостаткам известного способа, исключаемого заявленным способом относятся: необходимость забора большого количества крови, многоэтапность методик с необходимостью использования сложной аппаратуры и большого количества реактивов. Кроме того, известный способ дает маловероятный анализ и прогноз заболевания, в то время как патогенетической основой нарушений при хроническом гепатите является иммунопатологический процесс, ведущий к системному поражению различных органов, помимо печени.

Характеристика прототипа.

Наиболее точную информацию о состоянии патологического процесса при хроническом гепатите можно получать с помощью прижизненного морфологического исследования ткани печени методом пункционной биопсии печени (Мансуров Х.Х., Кутчак С. Н. "Биопсия печени", Душанбе, 1964, с. 19 - 27; Блюгер А.Ф. "Вирусный гепатит и его исходы", Рига, 1970, с. 272 - 279). После предварительного тщательного обследования для исключения противопоказаний (у больного исследуется кровь на геморрагический синдром с определением уровня тромбоцитов, протромбинового индекса, свертывания крови и времени кровотечения) проводится операция пункционной биопсии печени, которая у детей проводится следующим образом (Богомазов Ю. И. "Пункционная биопсия печени у детей", дисс. канд., 1965). Ребенок укладывается на спине на операционный стол; под масочным наркозом и парентеральным введением миорелаксантов обеспечивается отключение дыхательных движений на момент пункции печени. В периоде апноэ ребенку в области 9 межреберья справа по среднеподмышечной линии делают прокол пункционной иглой, с помощью которой извлекается столбик печеночной ткани, который срезу же должен быть помещен в фиксирующий 10% формалин или раствор Лилли и доставлен в патологоанотомическое отделение. В дальнейшем кусочек ткани печени проводится через спирты, заливается в парафин, затем из парафинового блока приготовляются срезы ткани, депарафинируются и последовательно окрашиваются стандартными красителями (гематоксилин-эозин, по Ван-Гизону, Браше и т.д.). Специалист-патологоанатом микроскопирует препараты и дает заключение о состоянии патологического процесса в печени.

Критика прототипа.

К недостаткам данного метода, устраняемого заявленным способом, относятся необходимость осуществлять пункционную биопсию печени в условиях специализированного хирургического стационара при наличии хорошо оборудованной операционной и высококвалифицированного состава специалистов - хирурга и анастезиолога. Следовательно, это может быть доступно лишь отдельным центральным клиникам страны. Кроме того, с учетом даваемого наркоза и оперативного вмешательства, пункционная биопсия печени является небезопасным способом, с которым связывают такие осложнения как кровотечение из места пункции, инфицирование плевры, а также повреждение соседних органов. В связи с этим после проведения пункции больной в течение 24 часов должен находиться в строгом постельном режиме с контролем за общим состоянием, уровнем артериального давления и пульса. Кроме того, следует учитывать те случаи, когда не удается добыть ткань печени, тогда пункция безрезультатна, а в 2 - 15% возможна и "сухая" пункция (см. Блюгер А.Ф. "Вирусные гепатиты и его исходы", Рига, 1970, с. 272 - 279). Нельзя не учитывать и значительную продолжительность времени от момента пункции до получения морфологического заключения (до 10 дней). К значительному недостатку следует отнести и невозможность проведения повторных исследований с необходимой частотой в динамике на фоне лечения.

Сущность изобретения.

Основной задачей (целью) заявленного изобретения является оценка тяжести патологического процесса при хроническом гепатите у детей, а также динамическая оценка эффективности проводимой терапии при данном заболевании.

Дополнительной целью является безопасность заявленного способа для жизни больного (минимальное количество забираемой крови из вены путем венепункции периферической вены с малой травматизацией ребенка).

Решение этой задачи достигается (в отличие от прототипа) тем, что в предлагаемом способе исключается дача наркоза, забор пунктата, а проводится забор венозной крови в количестве от 1 мл, к которой добавляется 25 ед. гепарина. Стандартным методом проводится выделение мононуклеарных клеток в градиенте фиколл-верографина путем центрифугирования в течение 45 мин при 4^oC. К осадку добавляют среду 199 или RPMI на буфере NaHCO₃, pH - 7,3 до объема 210 мл. 50 мкл мононуклеарных клеток в среде 199 с 40% эмбриональной телячьей сывороткой, инактивированной при 56^oC в течение 30 мин с гентамицином (40 мг/мл), наслаивают на предметное стекло, которое инкубируют 30 мин, при T = 37^oC. После промывки стекла в растворе Хенкса (37^oC) для удаления неприлипших клеток наслаивают 50 мкл зимозана, опсонизированного плазмой донора 0 (1) группы. Зимозан A (из дрожжей S, cerevisiae, SIGMA, USA) служит объектом фагоцитоза. После удаления зимозана раствором Хэнкса путем центрифугирования при 37^oC препарат окрашивают по Романовскому, микроскопируют с подсчетом количества клеток, захвативших зимозан. Показатель фагоцитарного индекса (ПФИ) равен отношению числа фагоцитирующих клеток к общему числу исследованных клеток, умноженному на 100%. Клетки, фагоцитирующие зимозан, широко распластываются, имея выраженную цитоплазму, при накоплении зимозана от 5 до 10 частиц ядро клеток смещается к периферии клетки и деформируется. Такая картина в гистологии фагоцитирующих мононуклеарных клеток расценивается как нормальная. Показатель фагоцитарного индекса в норме у здоровых детей равен 94,84,7% (по данным модифицированного метода В.А.Извековой, 1994 (фиг. 1)). Библиография аналога:

1. V.Myhrvold and B.Morland. - The use of frozen monocytes in phagocytosis studies. - Acta path. microbiol. immunol. scand. Sect. C, 93:43 - 48, 1985.

2. R.Bjerknes and C.F.Bassoe. - Human leykocyte phagocytosis of zumosan particles measured by flow cytometry. - Acta path. microbiol. immunol. scand. Sect. C 91:341 - 348, 1983.

На модифицированный метод оценки функции мононуклеарных клеток крови человека по уровню фагоцитарной активности (заявка на изобретение N 94-016319/14/016363) установлен приоритет от 5.5.1994 г.

Заявленным способом обследовано 40 больных в возрасте от 1 года до 14 лет, страдающих хроническим гепатитом B, D и C.

Выделены 2 группы больных с достоверно различимыми показателями фагоцитарной активности клеток системы мононуклеарных фагоцитов. Каждой из групп соответствовал определенный вариант воспалительного процесса в печени по данным пункционной биопсии печени.

В первой группе (11 детей), в основном с хроническим персистирующим гепатитом, клиническая картина характеризовалась малосимптомностью, а в пунктатах печени у этой категории больных были умеренно выражены инфильтративные и дистрофические проявления без выраженных деструктивных изменений паренхимы печени. Отмечался умеренный фиброз портальных трактов, сочетавшийся с умеренной лимфоцитарной и макрофагальной инфильтрацией.

Показатель фагоцитарного индекса в этой группе больных в среднем составил 552,3%, что свидетельствовало о достоверном умеренном снижении поглотительной способности клеток мононуклеарной фагоцитирующей системы, в том числе и о нарушении эффекторных реакций мононуклеарных фагоцитов в механизмах элиминации вирусных антигенов при данном заболевании (фиг. 2).

Во второй группе больных (29 детей) с хроническим активным гепатитом, в которой клинические проявления болезни были более манифестными и характеризовались наличием у всех больных астеновегетативного, гепатолиенального синдромов, а у половины больных, кроме того, выявлялись симптомы геморрагического синдрома, которые сочетались с другими внепеченочными поражениями органов (сердечно-сосудистой, билиарной системы, поджелудочной железы, легких, почек и др.). Морфологическая картина пунктатов печени данной группы детей отличалась более выраженными деструктивными явлениями с разрушением пограничной пластики, накоплением значительных перипортальных инфильтратов с включением в них плазматических клеток и фибробластов, а также выраженным разрастанием соединительной ткани в портальных трактах и внедрением ее с клеточными инфильтратами внутрь дольки. У детей с высокой активностью процесса в значительном количестве выявлялись ступенчатые некрозы.

В биохимических тестах имели место выраженные гиперферментемия, диспротеинемия, а у части больных - гипербилирубинемия. Для данной группы больных характерным было более глубокое угнетение фагоцитарной активности мононуклеарных клеток, что выражалось в снижении показателя фагоцитарного индекса до 24,29,9%, при этом до 70% клеток оставалось "неактивными", т.е. после обработки зимозаном не обнаруживалось признаков его захвата, клетки плохо распластывались, имели округлое ядро и слабовыраженную цитоплазму. Клетки же, захватившие зимозан, накапливали его в меньшем количестве (от 1 до 5 частиц), что также свидетельствовало о снижении функциональной активности этих клеток (фиг. 3).

Полученные результаты демонстрируют корреляцию между характером нарушений в функциональном состоянии мононуклеарных фагоцитов и глубиной патологического процесса в печени, что может быть использовано в качестве критерия оценки функционального состояния печени у больных с хроническими вирусными гепатитами и эффективности противовирусной и иммунокорригирующей терапии в ходе динамического наблюдения за больными.

Пример.

Реб. Дорощенко С. 10 мес., история болезни N 35632, от 1 беременности, протекавшей с токсикозом, срочных родов, весом 3200 г, закричала сразу, ранний период протекал без патологии. На естественном вскармливании до 2-х недельного возраста. В возрасте 2 мес. перенесла кишечную инфекцию, по поводу которой в условиях стационара получала инфузионную терапию. Мать и бабушка ребенка - носители HBsAg. С 2 мес. возраста у девочки постоянно фиксировался гепатолиенальный синдром со значительным уплотнением и увеличением размеров печени - до 5 - 6 см ниже реберного края. Однако до 10 мес. биохимического обследования и прочих исследований для уточнения его причин не проводилось. В 9,5 мес. ребенок был госпитализирован по поводу кишечной инфекции, где на фоне сальмонеллеза диагностировали холецистит, панкреатит и дисбактериоз. В биохимическом анализе крови был выявлен цитолитический синдром (АЛаТ - 494 ед. , АСаТ - 534 ед., при норме до 40 ед.), снижение уровней протромбинового индекса (до 60%) и -липопротеидов до 27 ед. (норма от 34 - 42 ед.). Методом ИФА обнаружен был HBsAg. Девочка была переведена в наш стационар, где по данным клинико-лабораторного и ультразвукового обследования был диагностирован "хронический гепатит B высокой степени активности с выраженными признаками фиброза ткани печени". В ходе вирусологического обследования методом ИФА были обнаружены HBeAg и анти-HBcIgM, что свидетельствовало об активной вирусной репликации. В биохимическом анализе крови в этот период выраженными были диспротеинемия, гипохолестеринемия, гиперферментемия: АЛаТ - 338 ед., АСаТ - 244 ед. В иммунологическом статусе от 5.1995 г. ОКТ₃ - 38% (норма - 69%), ОКТ₄ - 19% (норма - 46%), ОКТ₈ - 18% (норма). В тесте "кожного окна" во 2 фазе асептической воспалительной реакции (АВР) хемотаксис макрофагов составлял - 0%, при норме - 34,5%. Показатель фагоцитарного индекса составлял 10%, при норме - 94,8%.

Со стороны общих анализов крови и мочи патология не выявлена. С учетом активности гепатитного процесса и репликативной фазы HB-вирусной инфекции ребенку был назначен курс интерферонотерапии на срок 9 мес. с разовой дозой -2-интерферона - 1 млн. МЕ в виде свечей "Виферон". Помимо противовирусного действия данный препарат обладает и иммунокорригирующим эффектом. В процессе динамического обследования спустя 3 - 6 мес. отмечалось постепенное улучшение состояния ребенка: исчезли жалобы на повышенную утомляемость, потливость, снижение аппетита, девочка стала активной, в психофизическом развитии соответствовала возрасту; значительно сократились размеры печени и селезенки (печень - 8 см до начала лечения сократилась к этому сроку до 2 см, а селезенка сократилась с 3 см ниже реберного края до уровня реберного края). Несмотря на то что к 6 мес. от начала интерферонотерапии показатели цитолитического синдрома оставались еще значительно высокими (АЛаТ - 295 ед., а АСаТ - 199 ед.), в этом периоде отмечено было значительное повышение уровня фагоцитарного индекса, который составлял - 53%, в препарате не отмечено накопления неактивных форм мононуклеарных клеток. А спустя 3 мес., т.е. через 9 мес. от начала интерферонотерапии зарегистрировано наступление клинико-биохимической ремиссии, которая сохраняется в течение 1,5 лет. В маркерном спектре HB-вируса наступила сероконверсия HBeAg на анти-HBe, т.е. прекратилась активная репликация вируса, свидетельствующая об улучшении эффективных реакций фагоцитирующих клеток в элиминации вирусных антигенов.

Данный пример иллюстрирует ценность предлагаемого способа как для диагностического прогноза глубины патологического процесса в печени при хроническом гепатите, так и для оценки эффективности противовирусной и иммунокорригирующей терапии, которая может быть использована в качестве критерия сроков ее проведения.

Базовый иммунологический способ оценки функционального состояния печени (Т.В.Чередниченко, бюлл. N 44УДК 616.36.002.1.059.31/0888.8 опубл. 30.11.1985), где по уровню снижения хемотаксиса макрофагов в зоне асептического воспаления в коже судят о глубине патологического процесса в печени, в ряде случаев остается малоинформативным (даже у некоторых больных с циррозом печени или у гематологических больных), - он может оставаться нормальным. В то время как в заявленном способе на фоне нормальных показателей хемотаксиса либо при отсутствии миграции клеток в зону АВР в коже (тест "кожного окна" по Rebuck J.W., 1955) в мононуклеарных клетках периферической крови можно оценить их фагоцитарную активность, степень угнетения которой коррелирует с глубиной патологического процесса в печени при хроническом гепатите у детей.

Таким образом, заявленный способ отличается от базового иммунологического более высокой точностью.