способ определения циклоспорина ав крови

Формула изобретения

Способ определения циклоспорина А в крови, включающий обработку пробы крови реагентами, спектрофотометрический анализ результатов реакции и определение концентрации циклоспорина А с помощью калибровочной кривой, отличающийся тем, что пробу капиллярной крови наносят на хроматографическую бумагу в объеме 0,1 - 0,3 мл, высушивают ее при температуре 15 - 35^oC в течение 1,5 - 2 ч, а обработку крови осуществляют после разведения пробы с хроматографической бумаги 8 - 12 мл дистиллированной воды путем экстрагирования 80 - 100 мл метанола и центрифугирования, при этом калибровочную кривую строят по полученным данным.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и может быть использовано преимущественно при лабораторной диагностике степени иммуноподавления основного иммунодепрессанта - циклоспорина A - при трансплантации органов и аутоиммунных заболеваниях.

Циклоспорин A (Су A) является основным из иммунодепрессантов, используемых длительно после пересадки органов или при аутоиммунных заболеваниях. Возможность определения концентрации данного препарата в крови является важным преимуществом перед другими классами иммунодепрессантов. Способность каждого больного накапливать Су A в крови и тканях индивидуальна. При недостаточной дозе Су A возможно развитие криза отторжения пересаженного органа, при передозировке препарата - развитие вирусных и токсических осложнений.

Определять концентрацию Су A в крови возможно только в лабораториях крупных трансплантационных центров. Поэтому возникают проблемы при контролировании уровня Су A в крови больных, живущих далеко от клиники. Кроме этого, в ряде случаев возникает необходимость часто регулировать концентрацию Су A в крови, например, при дисфункции печени, заболеваниях желчевыводящей системы. Трудности со взятием проб крови для анализа возникают у пациентов с плохим доступом к венам.

Известен способ определения напряженности иммунитета, включающий анализ крови на фагоцитарную активность лейкоцитов и концентрацию циркулирующих иммунных комплексов (Патент РФ N 2058552, МПК G 01 N 33/53, публ. 1996).

Недостатком этого способа является повышенная трудоемкость и длительность определения степени иммуноподавления.

Известен способ определения циклоспорина A в крови, включающий обработку пробы крови реагентами, спектрофотометрический анализ результатов реакции и определение концентрации циклоспорина A с помощью калибровочной кривой (Патент РФ N 2074392, МПК G 01 N 33/52, публ. 1997, прототип).

Недостатком этого способа является то, что не все группы больных могут быть подвергнуты исследования данным способом, т.к. у ряда больных имеются сложности с сосудистым доступом, а некоторые проживают в отдаленных от трансплантационных центров районах.

Задача, поставленная авторами, - устранить указанные недостатки за счет обеспечения возможности определения концентрации циклоспорина A в капиллярной крови у больных, находящихся далеко от трансплантационного центра.

Для этого в способе определения циклоспорина в крови, включающем обработку пробы крови реагентами, спектрофотометрический анализ результатов реакции и определение концентрации циклоспорина A с помощью калибровочной кривой, предложено пробу капиллярной крови наносить на хроматографическую бумагу в объеме 0,1 - 0,3 мл, высушивать ее при температуре 15-35^oC в течение 1,5-2 ч, а обработку крови осуществлять после разведения пробы с хроматографической бумаги 8-12 мл дистиллированной воды путем экстрагирования метанолом 80-100 мл и центрифугированием, при этом калибровочную кривую строить по полученным данным.

То что проба крови помещается на хроматографическую бумагу, позволяет длительно сохранить ее и обеспечивает получение точного результата для дальнейшей коррекции лечения, позволяет сохранить пробу во время пересылки из отдаленных населенных пунктов. Дальнейшая обработка образца по предлагаемой методике позволяет, независимо от сроков поступления исследуемого материала в лабораторию, получить достоверно точные результаты иммуноподавления больного.

На чертеже представлены калибровочные кривые определения концентрации Су A в капиллярной крови, примеры 1, 2.

Способ осуществляется следующим образом.

Каплю крови в объеме 0,1-0,3 мл из пальца больного, получающего Су A орально, равномерно наносят на кусочек хроматографической бумаги так, чтобы образовавшееся пятно было около 2 см в диаметре. Пятно подсушивают при температуре 15-35^oC в течение 1,5-2 ч.

Стальным пробойником (диаметр 15 мм) вырубают кружок из середины пятна. Кружок с кровью разрезают ножницами на 4 части, помещают в полистереновую пробирку, добавляют 100 мкл дистиллированной воды и оставляют на 30 мин при комнатной температуре, периодически встряхивая на микрошейкере. Затем добавляют 900 мкл метанола, пробирки плотно закрывают, чтобы предотвратить испарение, и проводят экстракцию Су A в течение 1,5 ч. Полученный экстракт центрифугируют в течение 10 мин при 1500-2000 g и супернатант используют для определения концентрации Су A радиоиммунологическим методом. После экстраполяции данных по калибровочной кривой определяется концентрация Су A в крови больного.

Предложенный способ позволяет определять концентрацию Су A амбулаторных больных, живущих далеко от центра трансплантации, а также при необходимости частого взятия образцов крови и в случае плохого доступа к венам.

Пример 1.

Больная К. (ист. бол. N 12563, 1996) поступила с диагнозом: хронический нефрит, хроническая почечная недостаточность (ХПН) IV стадии. Пациентка длительное время находилась на лечении гемодиализом. За время лечения неоднократно формировались сосудистые доступы с использованием подкожных сосудов. После проведения аллотрансплантации в 1994 донорской почки необходимо было регулярно контролировать уровень Су A в крови для подбора адекватного иммуноподавления. В связи с отсутствием сосудов, доступных пункции для получения пробы крови, определение концентрации Су A производилось по описанной выше методике с помощью хроматографической бумаги. Наносили капиллярную кровь на хроматографическую бумагу в объеме 0,2 мл, высушивали ее при температуре 23^oC в течение 1,5 часов. В дальнейшем пробу крови разводили 10 мл дистиллированной воды, экстрагировали метанолом в объеме 80 мл и центрифугировали. Данную пробу обрабатывали спектрофотометрическим методом (радиоиммунологическое исследование) с построением калибровочной кривой. Полученные данные позволили судить о степени иммуноподавления. Получен результат: 200 нг/мл, что соответствует оптимальной иммунодепрессии (чертеж).

Пример 2.

Больная Е. (истор. бол. N 5026, 1997) поступила с диагнозом: хронический гломерулонефрит, ХПН IV стадии, хронический гепатит. Пациентке в 1995 году была выполнена аллотрансплантация почки. После проведенного лечения наблюдалась амбулаторно по месту жительства в отдаленном от больницы населенном пункте. Учитывая отдаленность нахождения больной и явления дисфункции печени вследствие перенесенного гепатита, для определения степени иммуноподавления был использован предлагаемый способ. Поступающие по почте хроматографические полоски с пробами капиллярной крови позволяли определять концентрацию Су A и корректировать степень иммуноподавления у данной пациентки. Например, после получения данных: 400 нг/мл, диагностировали избыточное иммуноподавление и произвели снижение дозировки препарата (чертеж).

Предлагаемый способ позволяет определять концентрацию Су A у амбулаторных больных, живущих далеко от трансплантационного центра, а также при необходимости частого забора образцов крови и в случае плохого доступа к сосудам.