аффинный сорбент для удаления фактора некроза опухоли и способ его получения

Формула изобретения

1. Аффинный сорбент для удаления фактора некроза опухоли, включающий носитель, на котором иммобилизован протеин, отличающийся тем, что в качестве протеина использован модифицированный ₂ -макроглобулин человека.

2. Способ получения аффинного сорбента для удаления фактора некроза опухоли путем иммобилизации протеина на носителе, отличающийся тем, что в качестве протеина используют ₂ -макроглобулин человека, который иммобилизуют при рН 7,0 - 8,2, а затем обрабатывают модификатором тиол-эфирной петли.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве модификатора тиол-эфирной петли используют монометиламина гидрохлорид.

4. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве модификатора тиол-эфирной петли используют протеолитический фермент плазмин плазмы крови человека.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и может найти применение при разработке новых подходов к лечению заболеваний, вызванных массивным поступлением цитокинов в кровь, например септического шока.

Наиболее близкими по сущности к предлагаемым сорбенту для удаления фактора некроза опухоли и способу его получения являются аффинный сорбент и способ получения сорбента, описанные в работе [1].

Аффинный сорбент содержит носитель, на который иммобилизованы моноклональные антитела к туморнекротизирующему фактору (TNF).

Способ получения аффинного сорбента предусматривает иммобилизацию протеина на носитель. В качестве протеина применены моноклональные антитела к TNF.

Моноклональные антитела представляют собой белок, чужеродный для организма человека. Эффект "подтекания" моноклональных антител с носителя в ходе процедуры удаления фактора некроза опухоли может приводить к сенсибилизации и ряду других нежелательных эффектов при лечебных процедурах. Кроме того, высокая стоимость и сложность получения моноклональных антител к TNF делает практически невозможным использование данного сорбента в клинических условиях.

Изобретение направлено на усовершенствование аффинного сорбента для удаления фактора некроза опухоли и разработку способа его получения. При этом обеспечена возможность клинического применения сорбента за счет исключения влияния попадания чужеродного для организма белка в кровь.

Фактор некроза опухоли (туморнекритизирующий фактор) является одним из эндогенных пирогенов, может вызывать гипотензию, существенные метаболические сдвиги (повышение углеводного обмена, истощение энергетических запасов, потерю адипоцитами липидов). Механизмами непосредственного действия TNF является также повышение экспрессии адгезивных молекул на поверхности эндотелия для лейкоцитов крови, в частности, для гранулоцитов, с чем может быть связано развитие гранулоцитопении. Кроме того, TNF опосредует синдромы "дырявых" капилляров и диссеминированного внутрисосудистого свертывания.

Сущность изобретений сводится к следующему.

Аффинный сорбент для удаления фактора некроза опухоли представляет носитель, на который иммобилизован ₂ - макроглобулин человека.

Способ получения аффинного сорбента для удаления фактора некроза опухоли предусматривает иммобилизацию протеина на носитель. В качестве протеина используют ₂ -макроглобулин человека, который иммобилизуют при pH 7,0...8,2, а затем обрабатывают модификатором тиол-эфирной петли.

Основной задачей при "посадке" ₂ -макроглобулина на носитель являлось получение препарата в нативной форме, что в дальнейшем позволило модифицировать белок, делая его пригодным для удаления (сорбции) TNF- из растворов.

Результаты наших экспериментов показали, что главным, решающим фактором при "посадке" является выбор pH-среды, при котором идет "пришивка" ₂ -макроглобулина к носителю. При pH ниже 7,0 заметно снижается количество (процент "пришивки") сорбируемого ₂ -макроглобулина, а при pH ниже 6,0 происходит необратимая денатурация белка.

При использовании буферов с pH выше 8,2 несмотря на высокой процент "сшивки" (в растворе остается менее 5% от исходного количества белка) происходят такие изменения конформации белка, которые существенно изменяют его свойства. Так, например такие препараты иммобилизованного ₂ -макроглобулина не способны связывать протеолитические ферменты. Эффективность использования этих препаратов для дальнейшей модификации и удаления TNF составляет менее 10% от оптимального, полученного при pH буферов 7,0...8,2. Эффективность "пришивки" при указанных значениях pH в среднем составляла 960,8%, что позволяет считать указанные выше значения pH оптимальными.

После иммобилизации ₂ -макроглобулин человека обрабатывают модификатором тиол-эфирной петли.

Модификатором тиол-эфирной петли может служить, например химический агент, выбранный из группы первичных аминов, или протеолитический фермент, способный связываться с ₂ -макроглобулином.

При обработке ₂ -макроглобулина, сорбированного на носителе указанными агентами, происходит разрыв тиол-эфирной петли в молекуле ₂ -макроглобулина, что приводит к его переходу в F-форму (Fost-форму), и он приобретает способность к связыванию TNF.

Удаление TNF с помощью иммобилизованного ₂ -макроглобулина представляется возможным при достаточной силе взаимодействия между ними.

Изобретение реализуется следующим образом.

Пример 1. Для конструирования сорбента использовали сефарозу 4B CL (Pnaracia, Швеция), которую активировали бромцианом (Fluka, ФРГ), как указано в работе [2].

В качестве аффинного лиганда использовали препарат человеческого ₂ -макроглобулина с концентрацией 1,5 мг/мл. Препарат был получен из донорской цитратной плазмы человека повторной гель-фильтрацией на колонке TSC-60 HW и ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе. Чистота препарата составляла свыше 95% по данным энзимологических тестов и ЭФ в ПААГ. Перед "посадкой" препарат ₂ -макроглобулина переводили в 0,15 М фосфатный буфер pH 7,0, содержащий 0,5 M NaCl. Проводили процедуру ковалентного "пришивания" белка.

После активации и отмывки ледяной дистиллированной водой на фильтре Шотта сефарозу добавляли к раствору ₂ -макроглобулина в объеме, равным объему раствора белка. Инкубацию смеси проводили в течение 2 часов при t=18-20^oC, а затем 16 часов при t=4^oC, постоянно перемешивая на роторной мешалке. После ряда промывок сорбента на фильтре Шотта собирали промывочный буфер, определяли его объем и концентрацию белка микробиуретовым методом. Расчет баланса позволял судить о количестве ковалентно связавшегося ₂ -макроглобулина. Далее проводили блокировку оставшихся активных групп 0,5 М глицином в 0,15 М фосфатном буфере с 0,5 M NaCl pH 7,9. Процедура занимала 2 часа при комнатной температуре и постоянном перемешивании на роторной мешалке. Окончательную отмывку сорбента осуществляли на фильтре Шотта, попеременно пропуская по 200 мл буферных растворов (0,1 Глицин-HCl буфер pH 3,00,1 и 0,15 М фосфатный буфер с 0,5 М NaCl pH 7,90,1). Смену буферов проводили 5 раз. Готовый сорбент помещали в 0,15 М фосфатный буфер pH 7,2 0,1.

Эффективность ковалентного связывания ₂ -макроглобулина на сорбенте составила 96%.

Пример 2. Удаление TNF- из забуферного физиологического раствора (ЗФР).

Готовили микроколонку объемом 2,0 мл геля (сорбента). Сорбент получали путем активации сефарозы 4 B CL бромцианом с последующей конъюгацией белка, находящегося в 0,15 NaCl при pH 7,9.

Колонку с иммобилизованным ₂ -макроглобулином промывали 0,5 М раствором монометиламина гидрохлорида в течение 30 мин при 20^oC. Далее вели элюацию.

Промывали колонку ЗФР (pH 7,2) в течение 30 минут со скоростью 20 мл/час при 20^oC, чтобы удалить с сорбента монометиламина гидрохлорид. Затем наносили образец, который содержал 10000 ЕД TNF- (0,6 мкг) в 1 мл ЗФР. После нанесения образца останавливали насос и через 15 минут инкубации продолжали элюцию ЗФР. Общая активность фракций элюата, содержащих TNF, составляла 800 ЕД. Таким образом, эффективность удаления составила свыше 90%.

Пример 3. Удаление TNF- из сыворотки крови человека.

Готовили микроколонку объемом 2,0 мл геля, полученного согласно примеру 2 при pH 8,2.

Затем наносили 3,0 мл донорской крови, в которую предварительно ввели 10000 ЕД TNF-.

Хроматографию проводили с помощью перистальтического насоса P-I (LKB, Швеция) со скоростью 20 мл в час. Сыворотка циркулировала по замкнутому контуру в течение 30 минут. Затем размыкали контур и вели элюацию ЗФР с указанной скоростью. Общая активность TNF- в элюате составляла 555 ЕД, т.е. менее 7% от исходной.

После отмывания этой колонки от сорбированного TNF- последовательно 0,9 М NaCl и ЗФР наносили еще один образец сыворотки, содержащей 10000 ЕД TNF-. Хроматографическую процедуру повторяли, как описано.

Эффективность удаления TNF- в результате повторной процедуры составила 91%, т.е. практически не ухудшилась.

Пример 4. В условиях примера 2 модификацию ₂ -макроглобулина проводили обработкой раствором протеолитического препарата фибринолизина (плазмина), который брали в двукратном избытке по отношению к иммобилизованному ₂ -макроглобулину (по молярности). Удаление TNF- из ЗФР проводили аналогично описанному в примере 1. Эффективность удаления TNF в данном эксперименте составила 92%.

Источники информации

1. Wilcher M., Mikon T., Kohr J. In: Methods in Enzymology, Jakoby W.B. (ed), Academic Press, New York, vol 104. p. 3, 1984.

2. Аффинная хроматография. Методы. - М.: Мир, 1988, с. 48-52. Редакторы П. Дин, У. Джонсон, Ф. Милд.