набор для ферментного анализа и способ его получения

Формула изобретения

1. Набор для ферментного анализа, содержащий в качестве основных функциональных компонентов твердые формы ферментов, индикаторного субстрата и буферных веществ, отличающийся тем, что в качестве буферных веществ он содержит аммонийные соли ортофосфорной кислоты.

2. Набор по п. 1, отличающийся тем, что он содержит основные функциональные компоненты в таблетированной форме.

3. Набор по п.2, отличающийся тем, что содержит основные функциональные компоненты в составе одной таблетки.

4. Набор по любому из пп. 1 - 3, отличающийся тем, что в составе индикаторного субстрата хромогенобразующего фермента пероксидазы он содержит 8-оксихинолин или его производные.

5. Набор по п.4, отличающийся тем, что в составе индикаторного субстрата он содержит 8-оксихинолинсульфонат.

6. Способ получения набора для ферментного анализа, содержащего в качестве основных функциональных компонентов твердые формы ферментов, индикаторного субстрата и буферных веществ, отличающийся тем, что готовые формы основных функциональных компонентов набора получают таблетированием, при котором в качестве наполнителя используют аммонийные соли, ортофосфорной кислоты, содержащиеся в составе набора в качестве буферных веществ.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ферментному анализу и может быть использовано для определения важнейших метаболитов (М) и биологически активных веществ (БАВ), например таких как глюкоза (диагностика и лечение сахарного диабета), холестерин (диагностика атеросклероза, мочекаменной болезни, ряда инфекционных заболеваний), этанола (криминалистика, контроль технологических процессов в микробиологической и пищевой промышленности) и других являющихся субстратами для соответствующих ферментов.

Серийные анализы таких М и БАВ, как правило, выполняются с использованием наборов готовых форм реагентов (диагностикумов), содержащих все необходимые компоненты для проведения анализа конкретного вещества, что обеспечивает быстроту и стандартизацию исследований.

При изготовлении наборов реагентов для серийных клинико-диагностических исследований используют химреактивы и биопрепараты в виде как растворов, так и твердых сухих (твердых) форм. Сухие формы реагентов предпочтительнее при реализации методик, основанных на применении ферментов, поскольку лиофильно высушенные препараты ферментов сохраняют свою активность дольше, чем те же препараты в растворах. Дополнительным преимуществом изготовления наборов на основе сухих форм является небольшой вес готовых форм реактивов.

В качестве прототипа могут быть выбраны наборы разных фирм, в частности фирмы KONE (Финляндия), ТЕСО (США), LABSYSTEMS (Финляндия).

Данные наборы представляют собой герметично закрытые флаконы, содержащие в качестве обязательных компонентов смесь (смеси) сухих веществ (в порошкообразном виде), а именно ферменты, индикаторные субстраты и буферные вещества [1.2]. (В качестве прототипа указан один из перечисленных наборов).

В качестве буферных веществ наборы содержат K/Na фосфаты. Схему применения ферментов при определении М или БАВ, являющихся соответствующими субстратами, можно изобразить в виде следующей последовательности реакций:



Концентрация окрашенных соединений пропорциональна концентрации субстрата, окисленного соответствующим ферментом (оксидазой), поэтому измерение оптической плотности реакционных смесей при длинах волн, соответствующих максимуму поглощения света образующимися окрашенными соединениями, обеспечивает определение концентрации М и (или) БАВ.

В частности, например, для определени глюкозы используют следующие сухие формы: в качестве ферментов - глюкозооксидазу и пероксидазу, в качестве индикаторного субстрата для пероксидазы-4-аминоантипирин и п-гидроксибензолсульфонат Na; в качестве буферной смеси - фосфаты K/Na [1].

Для определения холестерина используют те же вещества в расчетных количествах, кроме того, что вместо глюкозооксидазы диагностикум содержит смесь холестериноксидазы и холестеринэхстеразы [2].

Все известные ферментные наборы с сухими компонентами содержат в качестве буферного вещества K/Na фосфатный буфер, а если для цветовой реакции используют пероксидазу, то в качестве индикаторного субстрата используют 4-аминоантипирин и п-гидроксибензосульфонат Na.

Использование в ферментных наборах в качестве буферных систем K/Na солей ортофосфорной кислоты обусловлено их способностью поддерживать pH в области 5,8-8,0, соответствующей оптимуму стабильности и активности большинства ферментов.

Способ изготовления наборов для ферментного анализа включает высушивание, смешивание и гомогенизацию основных функциональных компонентов (ферментов, индикаторных субстратов и буферных веществ, находящихся в виде твердых форм) [1]. Затем эти компоненты расфасовывают по флаконам; флаконы вакуумируют или заполняют инертным газом и далее герметично укупоривают.

Все известные способы и наборы, основанные на использовании твердых форм реагентов, в том числе принятый для сравнения прототип, обнаруживают ряд существенных недостатков, проявляющих себя при организации серийного производства:

- требуется специальное, окупаемое только при больших объемах производства, автоматизированное оборудование для расфасовки сыпучих реагентов по флаконам, с дальнейшей их деаэрацией и укупоркой,

- флаконы с сухими порошкообразными реагентами имеют значительный объем и вес, что задает объем транспортной тары и создает сложности при их хранении, требующем термостатируемых условий и пониженной температуры;

- высокая удельная площадь поверхности порошкообразных реагентов ограничивает стабильность компонентов наборов;

- высушивание K/Na фосфатных буферных компонентов наборов требует высокой температуры и осуществляется под вакуумом, что проводит у усложнению технологической схемы, ее аппаратной реализации и, следовательно, увеличивает стоимость конечного продукта.

Предлагаемый способ и набор призваны устранить указанные недостатки.

Цель достигается тем, что набор для ферментного анализа, включающий основные функциональные компоненты в твердой форме: ферменты, индикаторный субстрат и буферные вещества, в качестве буферных веществ содержит аммонийные соли ортофосфорной кислоты.

Цель достигается тем, что основные функциональные компоненты диагностикума находятся в таблетированной форме, в том числе могут находится в составе одной таблетки (однореагентный набор).

Если в качестве хромогенообразователя набор содержит фермент пероксидазу, то предлагается использовать в качестве одной из компонент индикаторного субстрата 8-оксихинолин или его производные, в частности, 8-оксихинолин-сульфонат.

Для осуществления цели изобретения предлагается также новый способ изготовления (получения) набора для ферментного анализа, включающего в твердом виде основные функциональные компоненты: ферменты, индикаторный субстрат и буферные вещества, отличающийся тем, что готовые формы функциональных компонентов набора получают таблетированием, при котором в качестве наполнителя используют аммонийные соли ортофосфорной кислоты, содержащиеся в составе набора в качестве буферных веществ.

На сегодняшний день нет сведений об использовании совокупности этих взаимосвязанных признаков в каких-либо готовых изделиях либо в сообщениях научного или патентного характера, т.е. авторы не располагают све6дениями об использовании аммоний-фосфатов в качестве буферных компонентов в ферментных наборах; о таблетировании реагентов ферментных наборов с целью повышения их стабильности, оптимизации технологии упаковки, транспортирования и хранения; об использовании 8-оксихинолина или его производных в составе субстрата хромогенобразующего фермента.

Изобретение было разработано в процессе решения задачи по созданию технологии таблетирования сухих форм реагентов в ферментных наборах. В ходе соответствующих исследований было установлено, что основным препятствием при решении задачи являются физико-химические свойства веществ, используемых как составляющие компоненты реагентов набора; в частности буфера, а если в наборе используется пероксидаза, то физико-химические свойства компонентов, входящих в состав ее индикаторного субстрата.

Как известно, приготовление K/Na-фосфатной буферной смеси включает смешение гидратированных K/Na-солей, при этом происходит выделение воды. В ходе исследования было установлено, что характер взаимодействия молекул воды с K/Na фосфатами с одной стороны затрудняет высушивание содержащего эти соли буфера, с другой - осложняет процесс таблетирования, а именно высокое давление при прессовании приводит к высвобождению гидратированных молекул воды и, как следствие, намоканию и инактивации общей композиционный смеси.

Также было установлено, что наличие в составе индикаторно-субстратной смеси п-гидроксибензосульфоната в количествах, необходимых для проведения индикативной реакции в разумное время, приводит к недопустимо низкой прочности таблеток.

Была проведена работа по изысканию веществ, которые могли бы функциально заменить эти компоненты и обладали бы необходимыми физико-химических свойствами.

Как оказалось, аммоний-ортофосфатный буфер дает необходимый интервал pH, одно- и двузамещенный ортофосфаты аммония, не выделяет воду при смешивании и таблетировании, легко высушивается при комнатной температуре на воздухе.

Кроме того, было установлено, что аммоний-фосфатные композиции не обладают абразивными свойствами, что позволяет использовать их в качестве основного наполнителя таблетированных форм сухих реагентов диагностических наборов. При этом для таблетирования применяют стандартное оборудование и стандартные режимы работы, обеспечивающие полное сохранение функциональных свойств реагентов.

Для наборов, в которых в качестве хромогенобразователя используется фермент пероксидаза, было установлено, что вместо известного компонента индикаторного субстрата может быть использован 8-оксихинолин или его производные, например, 8-оксихинолин-сульфонат, которые обладают высоким средством к пероксидазе. Это позволяет использовать их в количествах, в которых эти соединения мало влияют на физико-химические свойства содержащих их композиционных смесей, что обеспечивает возможность их таблетирования. В процессе оптимизации составав композиционных смесей компонентов набора, имея в виду их дальнейшее таблетирование, а также согласования технологических возможностей оборудования с предлагаемыми весовыми и геометрическими характеристиками таблетированных компонентов, была обнаружена возможность сосуществования всех указанных основных компонентов в одной таблетке, т.е. стало возможным созданием набора, содержащего один реагент в виде одной таблетки.

Таким образом, выявленные закономерности позволяют как усовершенствовать известные способы получения порошкообразных ферментных наборов, предлагая альтернативные варианты композиций буфера и хромоген-субстратного компонента, новую перспективную форму этих наборов - реагенты в таблетированном виде, так и создать новый способ их получения.

Производные по предлагаемой технологии наборы представляют собой один или несколько типов таблеток, которые могут содержать смесь химически не взаимодействующих друг с другом веществ. Таблетированные реагенты упаковывают в многослойные ленточные материалы, обеспечивающие влаго-, а при необходимости, и светонепроницаемость типа БП(бумага-полиэтилен) или БФП(бумага-фольга-полиэтилен), или в другие аналогичные по функциональным свойствам упаковочные материалы.

Таблетированные формы реагентов компактны, для их получения и упаковки может быть использовано стандартное автоматизированное оборудование, применяющееся в фармацевтической промышленности, в том числе и для производства опытно-лабораторных серий. Это значительно упрощает и удешевляет процесс изготовления наборов. Упаковочный материал имеет минимальный вес и обеспечивает высокую степень сохранности реагентов в условиях транспортировки и хранения. Дополнительное преимущество таблетированных форм реагентов - более высокая стабильность по сравнению с порошкообразными, являющаяся следствием их значительно меньшей удельной площади поверхности реагирования с внешней средой.

Пример 1. Набор для ферментного анализа глюкозы и способ его получения (на 100 анализов).

Вариант I. Набор содержит, мг: сухая буферно-субстратная смесь 700-900 на 1 набор; сухая ферментная смесь 300-500 на 1 набор.

Способ получения набора заключается в высушивании, в том числе лиофилизации, смешивании и гомогенизации компонентов набора, указанных выше.

Получение буферно-субстратной смеси. Навески 170-210 мг аммония-ортофосфата однозамещенного (АФ-1) и 340-420 мг аммония-ортофосфата двузамещенного (АФ-2) сушат при комнатной температуре и нормальном атмосферном давлении в течение суток. Навески 90-220 мг 4-аминоантипирина (4-ААП), 45-120 мг 8-оксихинолина (8-ОХ) и 55-90 мг K/Na-хлористого тщательно перемешивают и добавляют к навескам аммоний-ортофосфатные соли. Полученную смесь тщательно гомогенизируют.

Получение ферментной смеси. Навеску глюкозооксидазы, соответствующую 3000-5000 ед. активности, и навеску пероксидазы, соответсвующую 1000-2000 ед. активности, растворяют в 200 мл 0,2 М аммоний-ортофосфатного буфера, pH7,00,2. Полученный раствор лиофилизируют.

К лиофилизированной смеси ферментов добавляют 10-15 мг MnSO₄, 200 мг аммоний-ортофосфатного буфера и K/Na-хлористый до общего конечного веса смеси 300-500 мг. Полученную смесь тщательно гомогенизируют.

Вариант II. Набор содержит таблетированную буферно-субстратную смесь (см. вариант I) - 2 таблетки на I набор; таблетированную ферментную смесь (см.вариант I) - 1таблетку на 1 набор.

Способ получения набора заключается в высушивании, в том числе лиофилизации, смешивании и гомогенизации компонентов набора, как это указано в варианте I с последующим таблетированием полученных буферно-субстратной и ферментной смесей. Таблетирование осуществляют на таблетирующем прессе РТМ-12 при давлении и скорости таблетирования в пределах рабочих технических характеристик этого оборудования.

Предварительно проводят пробное таблетирование; при отклонении веса таблеток в пределах 5% от расчетного приступают к таблетированию. Контроль веса таблеток и их прочности на разлом проверяют через каждые 10 мин.

Вариант III. Набор содержит таблетированную буферно-субстратно-ферментную смесь - 2 таблетки на 1 набор;

Способ получения набора заключается в высушивании, в том числе лиофилизации, смешивании и гомогенизации компонентов набора.

Навеску глюкозооксидазы, соответствующую 3000 - 5000 ед. активности, и навеску пероксидазы, соответствующую 1000 - 2000 ед. активности, растворяют в 200 мл 0,2 М аммоний-ортофосфатного буфера, (pH 7,0 0,2). Полученный раствор лиофилизируют.

2. К лиофилизированной смеси ферментов добавляют 10 - 15 мг MnSO₄, 90 - 120 мг 4-ААП, 45 - 60 мг 8-ОХ, 10 - 25 мг 8-оксихинолин-сульфоната (8-ОХС), 100 - 200 мг АФ-1 и 200 - 400 мг АФ-2 и K/Na-хлористого до общего конечного веса смеси 500 - 900 мг. Полученную смесь гомогенизируют и таблетируют, как это указано во II варианте.

Пример 2. Испытание наборов по примеру I (варианты I-III) на контрольных лабораторных растворах глюкозы.

Готовят три контрольных лабораторных раствора глюкозы с концентрациями 2,0; 5,0 и 15,0 ммоль/л и калибровочный раствор глюкозы с концентрацией 10,0 ммоль/л.

Навески буферно-субстратной смеси и ферментной смеси для варианта 1, или две таблетки буферно-субстратной смеси и 1 таблетку ферментной смеси для варианта II, или две таблетки буферно-субстратно-ферментной смеси для варианта III растворяют в 200 мл дистиллированной воды для каждого варианта (рабочий раствор для каждого варианта соответственно). Берут 21 пробирку (4 ряда по 5 пробирок и 1 пробирка - холостая проба для каждого варианта соответственно). Во все пробирки добавляют по 2 мл соответствующего рабочего раствора. В первый ряд пробирок добавляют по 25 мкл контрольного лабораторного раствора глюкозы с концентрацией 2,0 ммоль/л, во второй ряд - по 25 мкл контрольного лабораторного раствора глюкозы с концентрацией 5,0 ммоль/л, в третий ряд - по 25 мкл контрольного лабораторного раствора глюкозы с концентрацией 15 ммоль/л, в четвертый ряд - по 25 мкл калибровочного раствора глюкозы. Все пробирки встряхивают и инкубируют при 18 - 25^oС в течение 10 мин, после чего опять встряхивают и инкубируют еще 15 мин. Измеряют оптическую плотность на спектрофотометре типа СФ при длине волны 500 нм против холостой пробы. Для каждого ряда рассчитывают среднее арифметическое значение оптической плотности и концентрацию глюкозы по формуле 1

C = X_л/X_к ммоль/л

где X_л - среднее значение оптической плотности в определяемых пробах, ед.опт.пл.;

X_к - среднее значение оптической плотности в пробах с калибровочным раствором глюкозы, ед.опт.пл.;

10 - концентрация глюкозы в калибровочном растворе глюкозы, ммоль/л.

Отклонение значений концентраций в опытных пробах от теоретических величин рассчитывают по формуле 2

C = (C_k - C_л)/C_k100

где C_л - расчетная концентрация глюкозы, ммоль/л;

C_к - измеренная концентрация глюкозы в пробах с контрольным лабораторным раствором, ммоль/л.

Результаты эксперимента приведены в табл. I.

Отклонение в значениях концентраций не превышает ошибки измерения по выбранному методу 5%.

Пример 3. Набор для ферментного анализа холестерина и способ его получения.

Набор содержит: сухая смесь аммоний-ортофосфатного буфера и субстрата 700 - 1100 мг на один набор; сухая смесь ферментов холестериноксидазы 10 - 20 ед. активности, холестеринэстеразы 20 - 40 ед. активности, пероксидазы 50 - 110 ед. активности на один набор, 250 - 350 мг.

Способ получения данного набора включает высушивание, смешивание и гомогенизацию двух указанных смесей реагентов, а именно получение смеси буфера и субстрата.

Навески 200 - 300 мг АФ-1, 400 - 600 мг АФ-2, 40 - 80 мг натрия холиевокислого, 10 - 20 мг 8-ОХС, 50 - 100 мг 4-ААП смешивают и тщательно гомогенизируют.

Получение ферментной смеси.

Навески холестериноксидазы 10 - 20 ед. активности, холестеринэстеразы 20 - 40 ед. активности, пероксидазы 50 - 100 ед. активности смешивают с 200 мг аммоний-ортофосфатного буфера и с K/Na-хлористым до общего веса компонентов 250 - 350 мг. Смесь гомогенизируют.

Пример 4. Испытания наборов по примеру 3 на контрольных лабораторных растворах холестерина.

Готовят три контрольных лабораторных раствора холестерина с концентрацией 1,0 : 3,0 и 10 ммоль/л и калибровочный раствор холестерина с концентрацией 5 ммоль/л.

Навеску буферно-субстратной смеси растворяют в 50 мл дистиллированной воды. Навеску ферментной смеси растворяют в 1 мл дистиллированной воды. Смешивают оба раствора - рабочий раствор. Берут 21 пробирку (4 ряда по 5 пробирок и 1 пробирка - холостая проба). Во все пробирки добавляют по 2 мл рабочего раствора. В одну пробирку добавляют 20 мкл дистиллированной воды - холостая проба. В первый ряд пробирок добавляют по 20 мкл контрольного лабораторного раствора холестерина с концентрацией 1,0 ммоль/л, во второй ряд - по 20 мкл контрольного лабораторного раствора холестерина с концентрацией 3,0 ммоль/л, в третий ряд - по 20 мкл контрольного лабораторного раствора холестерина с концентрацией 10,0 ммоль/л, в четвертый ряд - по 20 мкл калибровочного раствора холестерина. Все пробирки встряхивают и инкубируют 30 мин при температуре 37^oС. Измеряют оптическую плотность на спектрофотометре типа СФ при длине волны 500 нм против холостой пробы. Для каждого ряда рассчитывают концентрацию холестерина по формуле 1. Отклонение значений концентраций холестерина в опытных пробах от расчетных величин определяют по формуле 2.

Результаты эксперимента приведены в табл. 2.

Отклонение в значениях концентраций не превышает ошибки измерения по выбранному методу - 5%.

Список литературы

1. Каталог фирмы ТЕСО (США). Набор для определения глюкозы. Инструкция по применению.

2. Каталог фирмы ТЕСО (США). Набор для определения холестерина. Инструкция по применению.