способ очистки коллазы

Формула изобретения

1. Способ очистки коллазы, включающий гомогенизацию гепатопанкреаса крабов в солевом буферном растворе, фракционирование материала сульфатом аммония и последующее его центрифугирование и очистку методом хроматографии с получением готового продукта, отличающийся тем, что в качестве хроматографического метода очистки используют гидрофобную хроматографию, причем сорбцию фермента на сорбент осуществляют при уравновешивании последнего буферным раствором соли в концентрации не менее 1,0 М, а элюцию фермента проводят при ступенчатом уменьшении концентрации буферного раствора соли до 0,025 М.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фракционирование материала сульфатом аммония осуществляют путем многократного его переосаждения указанным реагентом до 50%-ного насыщения.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве сорбента используют поливинилпирролидоновые носители.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве буферного раствора при сорбции продукта используют сульфат аммония, а при десорбции - бикарбонат аммония.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к препаративной биотехнологии и может быть использовано для получения очищенного препарата коллагеназы (коллазы) животного происхождения для применения в клеточной биотехнологии, парфюмерии и медицине.

Известен способ очистки коллагеназы, включающий гомогенизацию гепатопанкреаса крабов Paralithodes camtschatica в ацетоне при соотношении 1:8-12 и температуре 15 - 20^oC с последующей очисткой ацетоном и n-бутанолом. Удельная активность полученного фермента составляла 93 - 106 единиц на 1 мг белка. Затем проводят осаждение сульфатом аммония (50 - 80%) с последующей ионообменной хроматографией на носителе, содержащем диэтиламиноэтильные группировки, а сорбцию проводят при pH 5 - 7. В качестве носителя используют ДЭАЭ-сефарозу CL6B Pharmacia. Удельная активность полученной коллагеназы достигает 3500 - 4000 ед/мг белка (авт. св. СССР N 1526226, кл. C 12 N 9/64, 1993) [1].

Недостатком указанного способа очистки коллагеназы является то, что конечный продукт (коллагеназа) содержит вещества (пигменты, эластазу), которые с одной стороны являются полезными компонентами при использовании их в медицине, косметике (например, эластаза стимулирует рост волос), а с другой стороны вызывают у некоторой категории пациентов при накожном применении сильнейшее токсическое действие и аллергические реакции (Zweiman B, et al. Release of lactoferrin and elastase in human allergie skin reactions//J. Immunol. - 1990. - vol. 144, N 10. - p. 3953 - 3960) [2], а также участвуют в патогенезе некоторых заболеваний (Ledvina M. Role elastase and elastase-like enzymes in the pathogenesis of some diseases//Sb. ved Pr. Lek Fak Karlovu Univ. Hradcy Kralove, 1988, 31(5). - p. 455 - 472) [3]. Другим недостатком способа является использование в качестве сорбента для ионообменной хроматографии ДЭАЭ-сефарозы, являющейся природным полисахаридом. Такой сорбент быстро теряет свои свойства под действием ферментов, содержащихся в очищаемом продукте, т.е. не может быть использован многократно.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ очистки коллагеназы, включающий гомогенизацию гепатопанкреаса крабов в водных растворах, отделение центрифугированием нерастворенных веществ, добавление к супернатанту трет-бутилового спирта до его конечной концентрации 30 - 50% при 0 - 35^oC, перемешивание и добавление сульфата аммония до его концентрации 15 - 20%. Образовавшийся на разделе фаз осадок растворяют в буферном растворе и после ультрафильтрации или диализа последующую очистку осуществляют на ДЭAЭ-сефарозе, десорбируя фермент повышением ионной силы. Все операции проводят при температуре выше 0^oC. Удельная активность коллагеназы достигает 3500 - 4000 ед на 1 мг белка (авт. св. N 1699350, кл. C 12 N 9/64, 1991) [4] .

Недостатком указанного способа очистки коллагеназы, как и аналога [1] является то, что конечный продукт содержит вещества (пигменты, эластазу), которые с одной стороны являются полезными компонентами при использовании их в медицине, косметике (например, эластаза стимулирует рост волос), а с другой стороны вызывают у некоторой категории пациентов при накожном применении сильнейшее токсическое действие и аллергические реакции [2], а также участвуют в патогенезе некоторых заболеваний [3]. Другим недостатком способа является использование в качестве сорбента для ионообменной хроматографии ДЭAЭ-сефарозы, являющейся природным полисахаридом. Такой сорбент быстро теряет свои свойства под действием ферментов, содержащихся в очищаемом продукте, т.е. не может быть использован многократно.

Задачей предлагаемого изобретения является создание такого способа очистки коллагеназы (коллазы), который обеспечил бы очистку продукта от фермента эластазы и пигментов, а также позволил бы использовать такие сорбенты, которые многократно используются в технологическом процессе очистки указанного препарата.

Указанная задача решается тем, что в способе очистки коллагеназы (коллазы), включающем гомогенизацию гепатопанкреаса крабов в солевом буферном растворе, фракционирование материала сульфатом аммония и последующее его центрифугирование и очистку методом хроматографии с получением готового продукта, согласно изобретению в качестве хроматографического метода очистки используют гидрофобную хроматографию, причем сорбцию фермента на сорбент осуществляют при уравновешивании последнего буферным раствором соли в концентрации не менее 1,0 М, а элюцию фермента проводят при ступенчатом уменьшении концентрации буферного раствора соли до 0,025 М. В качестве буферного раствора при сорбции продукта используют сульфат аммония, а при десорбции - бикарбонат аммония.

Причем для удаления балластных белков и пигментов и снижения нагрузки на сорбент-носитель фракционирование материала сульфатом аммония осуществляют путем многократного его переосаждения указанным реагентом до 50%-ного насыщения.

В качестве сорбента используют поливинилпирролидоновые носители, например типа Fractogel или Toyperl, которые не теряют своих свойств под действием ферментов, содержащихся в очищаемом продукте, и могут быть использованы многократно.

Разделение белков методом гель-фильтрации с использованием поливинилпирролидоновых носителей в присутствии высоких концентраций соли происходит по смешанному механизму. Этот механизм включает фракционирование белков по размерам молекул и гидрофобную хроматографию, при которой элюция сорбированных белков происходит при понижении ионной силы раствора.

Ферментный препарат коллаза, выделенный из гепатопанкреаса Камчатского краба предлагаемым способом (ВФС 42-399 ВС-93, введен в действие с 12.07.93), представляет собой комплекс протеолитических ферментов с коллагенолитической и казеинолитической активностью. Препарат обладает некролитической активностью, обусловленной действием двух изоферментов сериновой коллагенолитической протеазы A и C; расщепляет коллаген, способствующий старению кожи человека; имеет фибринолитические и тромболитические свойства. Протеолитическая активность - не менее 0,9 ед. а./мг белка. Коллагенолитическая активность при pH 7-8 составляет не менее 500 ед.а./мг белка. Препарат практически не теряет активности в течение 4-х лет хранения в лиофильно высушенном состоянии при температуре + 10^oC.

Пример 1. Технология очистки коллазы.

Навеску размороженного гепатопанкреаса крабов Paralithodes camtchatika, равную 250 г, предварительно гомогенизируют в 250 мл 2,0 М раствора хлористого натрия и центрифугируют в течение 15 мин при частоте вращения ротора 9000 об/мин. Собирают надосадочную жидкость, фильтруют через хлопчатобумажную вату для удаления остатков жира и добавляют 150 мл 3,0 М сульфата аммония с последующим центрифугированием при тех же условиях. При этом частично удаляются из продукта балластные белки и пигменты, представляющие собой тончайшую взвесь нерастворимых частиц. Супернатант наносят на колонку размером 5,0 х 25,0 см (объем 491 мл), заполненную поливинилпирролидоновым сорбентом (носителем), например типа Toyopearl, и уравновешенную 1,0 М раствором сульфата/бикарбоната аммония. Колонку промывают этим же раствором до полного выхода пигментированных белков. Затем продолжают промывку колонки 0,75 М раствором сульфата/бикарбоната аммония от балластных белков, после чего элюируют фермент 0,025 М раствором бикарбоната аммония. Собирают фракции, обладающие протеолитической активностью. Полученный элюат обессоливают диализом против 0,025 М раствора бикарбоната аммония в течение 24 ч с двукратной сменой раствора. В результате получают высокоочищенный ферментный препарат, обладающий протеолитической (0,7 е.а./мг) и коллагенолитической активностью (730 е.а./мг). Выход по белку составил 22,0%.

Пример 2. Технология очистки коллазы с предварительным многократным переосаждением сульфатом аммония.

Навеску размороженного гепатопанкреаса крабов Paralithodes camtchatika, равную 320 г, предварительно гомогенизируют в 375 мл 2,0 М раствора хлористого натрия и центрифугируют в течение 15 мин при частоте вращения ротора 9000 об/мин. Собирают надосадочную жидкость, фильтруют через хлопчатобумажную вату для удаления остатков жира, добавляют в течение часа постепенно сульфат аммония до 50%-ного насыщения и центрифугируют в течение 20 мин при частоте вращения ротора 9000 - 10000 об/мин. Надосадочную жидкость выливают, а оставшийся осадок препарата фермента растворяют в 100 мл 0,025 М бикарбоната аммония. В полученный раствор при перемешивании добавляют вновь сульфат аммония до 50%-ного насыщения и центрифугируют, как указано выше.

Надосадочную жидкость выливают, а оставшийся осадок препарата фермента растворяют в 100 мл 0,025 М бикарбоната аммония и повторяют процедуру осаждения препарата фермента сульфатом аммония и центрифугирование. Полученный осадок белка в количестве 10 г растворяют в 100 мл 1,0 М раствора сульфат/бикарбонат аммония и проводят дальнейшие процедуры очистки препарата фермента на поливинилпирролидоновом сорбенте-носителе (Fractogel) и его диализ, как описано в примере 1.

Выход белка по приведенной технологии составляет 24,0%. Протеолитическая активность полученного препарата фермента составляет 1,2 е.а./мг, а коллагенолитическая активность - 714 е.а./мг.

Экспериментальные исследования показывают, что при невысоких нагрузках на носитель протеолитические ферменты полностью удерживаются на поливинилпирролидоновом сорбенте и удаляются с колонки в 0,025 М бикарбонате аммония. При нагрузке более 15 мг/мл сорбента и скорости нанесения более 0,08 см/мин часть протеолитической активности элюируется 0,75 М сульфатом аммония. Наибольший выход фермента составляет 12,0 - 15,0 мг/мл сорбента.

Специальной процедуры регенерации сорбента после каждой хроматографии не проводилось, следовательно, поливинилпирролидоновые носители могут использоваться в технологии получения коллагеназы многократно при тщательном удалении нерастворимых компонентов перед нанесением образца на колонку, по крайней мере в течение 10 циклов без ухудшения качества разделения.

Эффективность удаления примесей, включая пигменты и белки, значительно выше, чем в способах-аналогах и прототипе, что подтверждается при изучении токсических и аллергизирующих свойств коллазы. В препаратах коллазы активность эластазы не обнаружена.

Для изучения специфической активности препарата коллазы проведены исследования в условиях экспериментальной патологии у лабораторных животных.

Пример 3. Изучение токсических свойств коллазы.

Для изучения токсических эффектов препарата был выбран парентеральный способ введения, а именно внутрижелудочный.

Установлено, что однократное внутрижелудочное введение препарата коллазы (коллагеназы) в дозе 5 г/кг массы тела не вызывало гибели животных в течение всего эксперимента, что позволяет отнести препарат к классу малотоксичных соединений, согласно ГОСТ 12.1.007-76.

Введение препарата не приводило к нарушению поведенческих реакций, потребления пищи и воды. Значения массы тела, пульс и двигательная активность животных после введения коллазы колебались в пределах физиологической нормы. Вместе с тем, отмечалось достоверное снижение температуры тела мышей в первые 5 ч после введения препарата с последующей нормализацией через 1 сутки.

Введение препарата сопровождалось повышением содержания гемоглобина крови мышей через сутки, с последующей нормализацией через 7 сут после инъекции. Изменения других гематологических показателей не наблюдалось. Не обнаружено существенного влияния коллазы на биохимические показатели: уровень общего белка, холестерина, глюкозы, аланинаминотрансферазы, общую протеолитическую и антитриптическую активность.

Пример 4. Результаты оценки кожно-раздражающего действия коллазы.

Девятикратное нанесение препарата коллазы (коллагеназы) в объеме 0,1 см³ на выстриженный участок кожи спины крыс не вызывало изменения температуры и массы тела животных. Колебания показателей частоты сердечных сокращений опытных животных через сутки после аппликаций и в конце 10-дневного восстановительного периода не выходили за пределы физиологической нормы для этого вида животных.

Гематологические показатели в опытной группе не отличались от контрольного уровня как через сутки после аппликаций, так и после восстановления. Не обнаружено влияния апплицирования фермента на биохимические показатели крови (белок, холестерин, глюкоза, активность АлТ, протеолитическая и антитриптическая активность).

Изучение весовых индексов органов не выявило их изменения через сутки после инъекции препарата по сравнению с показателями контрольной группы. Однако после 10 дней восстановления отмечено статистически достоверное снижение индекса тимуса на 36% и возрастание весового индекса сердца на 11% в опытной группе животных. Макроскопическая картина внутренних органов мало различалась у крыс контрольной и опытной групп.

Следовательно, препарат коллазы (коллагеназы) не обладал выраженным кожно-резорбтивным действием.

При гистологическом изучении кожи крыс через сутки после окончания аппликаций препарата наблюдались изменения в виде утолщения эпидермиса, в основном за счет зернистого слоя, дистрофические изменения эпидермальных клеток, отмечалась лейкоцитарная инфильтрация дермы.

В случае небольших повреждений кожи при стрижке развивалась выраженная воспалительная реакция в дерме с обильной полиморфно-ядерной инфильтрацией, гиперемией. Через 10 сут после окончания аппликаций микроструктура кожи у опытных животных не отличалась от контроля.

Однократное нанесение препарата коллазы не вызывало каких-либо признаков раздражения слизистых оболочек глаз кроликов.

Пример 5. Данные об аллергизирующих свойствах коллазы.

При кожном тестировании и при тестировании методом конъюктивальной пробы препарат не проявил выраженных сенсибилизирующих свойств. В то же время, в тесте на анафилаксию выявлены признаки анафилактической реакции в виде чихания и почесывания мордочки у животных (анафилактический индекс 1,5).

Результаты исследования коллазы показали, что у морских свинок, сенсибилизированных препаратом, отсутствовали признаки развития кожной аллергической реакции.

Признаков гиперемии или отека после введения тестирующей дозы препарата выявлено не было. Не обнаружено отличий конъюнктивы контрольных животных и свинок, сенсибилизированных препаратом мази коллазы.

Таким образом, препарат коллазы проявлял аллергенные свойства только при внутривенном тестировании на анафилаксию.

Пример 6. Исследование протеолитической и коллагенолитической активностей препарата коллаза.

Определение протеолитической активности препарата проводят по стандартной методике в соответствии с ГОСТом 20264.2-88.

Данные по протеолитической активности предлагаемого препарата коллазы и коммерческого препарата коллагеназы фирмы Sigma Chemical Co., (Klimova, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 166, 1411 (1990) приведены в таблице.

Определение удельной коллагенолитической активности предлагаемого препарата проводят по методике МА 123.12.002-92. Методика включает гидролиз коллагена исследуемым препаратом до пептидов и аминокислот и определение продуктов гидролиза. Одна единица коллагенолитической активности гидролизует коллаген с высвобождением пептидов в количестве, эквивалентном 1 мкмолю L-лейцина, окрашенных нингидрином за 1 ч при температуре (37,0 0,2)^oC и водородном показателе 7,4 pH в присутствии ионов кальция.

Данные по коллагенолитической активности предлагаемого препарата представлены в таблице.

Сравнительные данные по исследованию протеолитической активности предлагаемого препарата с активностью, например, препарата-аналога (коллагеназа фирмы Sigma) показывает, что они близки по своим характеристикам.

Предлагаемый способ получения коллазы (коллагеназы) позволяет получать продукт, свободный от пигментов и примесей, обладающих эластазной активностью, что позволяет его использовать более широко в медицине и косметике.