питательная среда для культивирования пыльников льна

Формула изобретения

Питательная среда культивирования пыльников льна, включающая кальций хлористый двухводный, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий азотнокислый, магний сернокислый семиводный, аммоний азотнокислый, железо сернокислое семиводное, этилендиамин-тетрацитат натрия (ЭДТА) одноводный, кобальт хлористый шестиводный, медь сернокислую пятиводную, кислоту борную, калий иодистый, марганец сернокислый одноводный, натрий молибденовокислый двухводный, цинк сернокислый семиводный, мезоинозит, тиамин, глутамин, сахарозу, уплотнитель, 6-бензиладенин, кислоту нефтилуксусную и бидистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит пантотенат кальция, кислоту никотиновую, пиридоксин, аспарагин, глицин, серин, кислоту индолилуксусную, и в качестве уплотнителя агар-агар при следующем соотношении компонентов, мг/л:

Кальций хлористый двухводный - 435

Калий фосфорнокислый однозамещенный - 170

Калий азотнокислый - 1900

Магний сернокислый семиводный - 370

Аммоний азотнокислый - 1650

Железо сернокислое семиводное - 27,8

Этилендиамин-тетрацитат натрия (ЭДТА) одноводный - 37,3

Кобальт хлористый шестиводный - 0,025

Медь сернокислая пятиводная - 0,025

Кислота борная - 6,2

Калий иодистый - 0,75

Марганец сернокислый одноводный - 22,3

Натрий молибденовокислый двухводный - 0,25

Цинк сернокислый семиводный - 8,6

Мезоинозит - 100

Пантотенат кальция - 4

Кислота никотиновая - 0,5

Пиридоксин - 0,5

Тиамин - 0,1

Аспарагин - 250

Глицин - 2

Глутамин - 25

Серин - 125

Сахароза - 50000

Агар-агар - 7000

6-Бензиладенин - 1

Кислота нафтилуксусная - 0,5

Кислота индолилуксусная - 0,3

Бидистиллированная вода - Остальное до 1 лл

Описание изобретения к патенту

Изобретение находится к биотехнологии, в частности к культивированию in vitro льна, и может быть использовано при культивировании пыльников растений для получения нового исходного материала.

Известны многочисленные питательные среды для культивирования пыльников растений, которые содержат необходимые компоненты для индуцирования процесса образования каллуса и эмбриоидов на их основе (Ф.А. Калинин и др. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев: Наукова думка, 1980. С. 238-242). Показано, что нет универсальной питательной среды позволяющей получить достаточный результат на разных растениях, в связи с чем разрабатываются среды для конкретных видов растений (Биотехнология растений: культура клеток /Пер. с англ. В.И. Негрука; с предисл. Р.Г. Бутенко. М.: Агропромиздат. 1989. 280 с. (с. 41-43)). Применение основных хорошо зарекомендовавших себя сред таких как N₆ (Cu С.С., 1978), МС (Murashige, Skoog, 1962), Монниера (Monnier М. , 1978), B₅ (Gamborg O.L., 1965) и др. на льне сопровождалось образованием лишь отдельных случаев каллусирования пыльников или возникновения эмбриоидов на их основе.

Известна питательная среда (ближайший аналог) для культивирования пыльников льна, называемые A 22 (Nichteriein K., et al. New methods and recent progress in the breeding of fiax / Flax as a fibre and oil bearing crop. Proceedings of the FAO European regional workshop on flax.-Brno, Czechoslovakia, 18-20 June 1991. P. 175-183; Nichterlein K., Umbach H., Friedt W. Genotypic and exogenоus factors affecting shoot regeneration from anther callus of linseed (Linum usitatissimum L). Euphytica. 1991. 58. P. 157-164), которая содержит (мг/л): кальций хлористый двухводный - 435; калий фосфорнокислый однозамещенный - 170; калий азотнокислый - 1900; магний сернокислый семиводный - 370; аммоний азотнокислый - 165; железо сернокислое семиводное - 27,8; этилендиамин-тетрацитат натрия ((ЭДТА) одноводный - 37,3; кобальт хлористый шестиводный - 0,025; медь сернокислую пятиводную - 0,025; кислоту борную - 6,2; калий иодистый - 0,75; марганец сернокислый одноводный - 22,3; натрий молибденовокислый двухводный - 0,25; цинк сернокислый семиводный - 8,6; мензоинозит - 100; тиамин - 0,1; глутамин - 750; сахарозу - 60000; агарозу - 4000; 6-бензиладенин - 2,0; нафтилуксусную кислоту - 1,0.

Недостатком этих сред является низкий выход каллусирующих пыльников льна-долгунца и пыльников с эмбриоидами. Увеличение частоты образования капсулирующих пыльников у льна очень важно, так как технология культуры пыльников in vitro довольно дорогостоящая, к тому же селекционеры не всегда располагают достаточным количеством ценного растительного материала. Повышение же частоты каллусогенеза позволяет уменьшить объем приготовления среды, лабораторной техники, объем растительного материала, расход рабочего времени и создает базу для технологии массового получения регенерантов в культуре пыльников льна.

Заявляемое изобретение направлено на устранение вышеотмеченных недостатков и от его использования может быть получен следующий технический результат: увеличение выхода каллусирующих пыльников с 5,8% до 11,5% (или в два раза больше).

Указанный технический результат достигается за счет того, что в питательную среду, включающую следующие компоненты: кальций хлористый двухводный, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий азотнокислый, магний сернокислый семиводный, аммоний азотнокислый, железо сернокислое семиводное, этилендиамин-тетрацитат натрия ((ЭДТА) одноводный, кобальт хлористый шестиводный, медь сернокислую пятиводную, кислоту борную, калий иодистый, марганец сернокислый одноводный, натрий молибденовокислый семиводный, мезоинозит, тиамин, глутамин, сахарозу, уплотнитель 6-бензиладенин, кислоту нафтилуксусную и бидистиллированную воду, дополнительно вводят пантотенат кальция (4,0), кислоту никотиновую (0,5), пиридоксин (0,5), аспарагин (250), глицин (2,0), серин (125), кислоту индолилуксусную (0,3) и в качестве уплотнителя она содержит агар-агар (700).

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Пыльники льна культивируют на среде, известной ранее, которую готовят по следующей технологии. В 400 мл бидистиллированной воды добавляют 7000 мг агар-агара и путем кипячения готовят агаровый гель. Затем в него добавляют растворенные в бидистиллированной воде ингредиенты (мг/л): кальций хлористый двухводный - 435; калий фосфорнокислый однозамещенный - 170; калий азотнокислый - 1900; магний сернокислый семиводный - 370; аммоний азотнокислый - 165; железо сернокислое семиводное - 27,8; этилендиамин-тетрацитат натрия ((ЭДТА) одноводный - 37,3; кобальт хлористый шестиводный - 0,025; медь сернокислую пятиводную - 0,025; кислоту борную - 6,2; калий иодистый - 0,75; марганец сернокислый одноводный - 22,3; натрий молибденовокислый двухводный - 0,24; цинк сернокислый семиводный - 8,6; мезоинозит - 100; тиамин - 0,1; глутамин - 750; сахарозу - 60000; агарозу - 4000; 6-бензиладенин - 2,0; нафтилуксусную кислоту - 1,0. Общий объем приготавливаемой среды доводится до 1000 мл добавлением бидистиллированной воды. Затем среду тщательно перемешивают. Раствором NaOH устанавливают pH среды 5,5-5,6.

Горячую питательную среду разливают в большие биологические пробирки, которые закрывают алюминиевой фольгой и автоклавируют при 0,75 атм. два раза по 15 минут. Пыльники льна высаживают на застывшую агаризованную поверхность в стерильных условиях. Пробирки с пыльниками помещают в термостат при температуре 23-27^oC и отсутствие света. Через 28 дней подсчитывают количество пыльников, давших каллус объемом более 5 мм³ (табл.).

Пример 2. Условия проведения эксперимента аналогичны описанным в примере 1, но содержание компонентов в предлагаемой среде, следующее (мг/л): кальций хлористый двухводный - 435; калий фосфорнокислый однозамещенный - 170; калий азотнокислый - 1900; магний сернокислый семиводный - 370; аммоний азотнокислый - 1650; железо сернокислое семиводное - 27,8; этилендиамин-тетрацитат натрия ((ЭДТА) одноводный - 37,3; кобальт хлористый шестиводный - 0,025; медь сернокислая пятиводная - 0,025; кислота борная - 6,2; калий иодистый - 0,75; марганец сернокислый одноводный - 22,3; натрий молибденовокислый двухводный - 0,25; цинк сернокислый семиводный - 8,6, мезоинозит - 100; тиамин - 0,1; глутамин - 25; пантотенат кальция - 4,0; кислота никотиновая - 0,5; пиридоксин - 0,5; аспарагин - 250; глицин - 2,0; серин - 125; сахароза - 50000; агар-агар - 7000; 6-бензиладенин - 1,0; нафтилуксусная кислота - 0,5; кислота индолилуксусная - 0,3.

Как следует из экспериментальных данных, использование предлагаемого варианта питательной среды обеспечивает увеличение каллусогенеза относительно известных питательных сред минимум в 2 раза.