пептиды, обладающие органозащитной активностью, фармакологически активная композиция

Формула изобретения

1. Пептиды общей формулы I



содержащие от 8 - 15 аминокислотных остатков в цепи,

где Xaa - остаток нейтральной алифатической аминокислоты, подобный Ala, -Ala, Leu, Ile, Gly, Val, Nle, Nva;

Yaa - остаток аминокислоты основного характера, подобный Lys, Arg, Orn, His;

Zaa - остаток аминокислоты кислотного характера, подобный Glu, Asp, Aad, Apm,

и по меньшей мере один из остатков Xaa и Zaa может быть пропущен.

2. Пептиды по п. 1, в которых молекула циклизована путем образования амидной связи между первым и последним аминокислотными остатками.

3. Пептид по пп.1 и 2, имеющий последовательность в цепи с индентифицирующим номером 1



4. Пептид по пп.1 и 2, имеющий последовательность в цепи с идентифицирующим номером 2



5. Пептид по пп.1 и 2, имеющий последовательность в цепи с идентифицирующим номером 3



6. Пептид по пп.1 и 2, имеющий последовательность в цепи с идентифицирующим номером 4



7. Пептид по пп.1 и 2, имеющий последовательность в цепи с идентифицирующим номером 5



8. Пептид по пп.1 и 2, имеющий последовательность в цепи с идентифицирующим номером 6



9. Пептид по пп.1 и 2, имеющий последовательность в цепи с идентифицирующим номером 7



10. Пептид по пп.1 и 2, имеющий последовательность в цепи с идентифицирующим номером 8



11. Пептид по пп.1 и 2, имеющий последовательность в цепи с идентифицирующим номером 9



12. Пептид по пп.1 и 2, имеющий последовательность в цепи с идентифицирующим номером 10



13 Пептид по пп.1 и 2, имеющий последовательность в цепи с идентифицирующим номером 11



14. Пептиды по п.1 формулы I, где по меньшей мере один и самое большее семь аминокислотных остатков с 1 по 15 отсутствуют.

15. Пептиды по п.1, обладающие органозащитной активностью.

16. Фармакологически активная композиция, обладающая органозащитным действием на основе пептида и обычных добавок, отличающаяся тем, что в качестве пептида она содержит одно или несколько соединений по пп.1 - 15 в эффективных количествах.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к новым пептидам с органозащитной активностью обладающим высоким биологическим действием такого же типа, как природное соединение ВРС, но имеющим более короткие аминокислотные цепи.

Биологически активный белок с органозащитной активностью, который выделен из тела животного или человека и назван ВРС (защищающее организм соединение), описан в Европейском патенте 0432400, а также опубликован в P.Siciric et. al., Exp. Clin. Gastroenterol, I, 15-26, 1991. Белок имеет мол. массу около 400005000, строение его определено только частично. Это соединение обладает биологической активностью широкого спектра действия: защищает от язвы, обладает гепатозащитной, антивирусной, противоотечной, общей противовоспалительной, противораковой и аналогичной активностью. Его применяют в терапии упомянутых заболеваний, а также в терапии заболеваний и нарушений деятельности нервной системы и нарушений допаминергической этиологии, хирургии, стоматологии, при восстановлении способности к воспроизведению потомства и в ветеринарной медицине. Но такой широкий спектр активности может быть следствием только частично определенной структуры или даже недостаточной чистоты и гомогенности выделенного соединения ВРС.

В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения предложен класс синтетических пептидов, обладающих неожиданно высокой биологической активностью, особенно при защите живого организма. В любом случае эти синтетические соединения с хорошо установленной структурой много предпочтительнее, чем высокомолекулярный белок ВРС с частично установленным строением, который можно получать только сложным способом из сомнительного природного источника.

Более конкретно, это изобретение относится к новому классу очень биологически активных пептидов, содержащих 8-15 аминокислотных остатков. Пептиды представлены следующей основной структурной формулой (применяются трехбуквенные аминокислотные обозначения, а числа под аминокислотными остатками соответствуют положению остатка в пептидной цепи)



Значения заместителей Xaa, Yaa и Zaa приведены в таблице.

Предпочтительные согласно изобретению пептиды имеют формулу:

Последовательность с идентифицирующим номером 1 (сокращение: посл. с ид. N 1).

Посл. с ид. N 2



Посл. с ид. N 3



В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены аналогичные пептиды, которые в С-концевом положении имеют амидогруппу или карбоксигруппу. Эти пептиды имеют указанные выше структурные формулы, в которых по меньшей мере один и не более семи аминокислотных остатков в положениях 1-15 отсутствуют и по меньшей мере один из заместителей Xaa, Yaa и Zaa имеет значение, указанные в таблице.

Предпочтительны пептиды следующих формул:

Посл. с ид. N 4



Посл. с ид. N 5



Посл. с ид. N 6



Посл. с ид. N 7



Посл. с ид. N 8



В соответствии еще с одним аспектом изобретения пептиды, которые имеют указанные выше структурные формулы и у которых по меньшей мере один из аминокислотных остатков отсутствует и по меньшей мере один из остальных аминокислотных остатков замещен, как указано в таблице, трансформированы в циклическую форму путем образования новой связи CO-NH между первым и последним аминокислотными остатками в молекуле.

Предпочтительные следующие пептиды:

Посл. с ид. N 9



Посл. с ид. N 10



Было найдено, что описанные в настоящем изобретении пептиды обладают биологической активностью, равной указанной выше активности белка ВРС, или превышающей ее.

Фармакологические исследования описанных пептидов проводили на различных обычных образцах "in vitro" и "in vivo". Обнаружены следующие фармакологические свойства:

1)Защитное действие на печень и поджелудочную железу

Защитное действие новых синтезированных пептидов, имеющих посл. с ид. N 2, 3, 4, 6, сравнения с действием стандартов (бромокриптина, адамантадина, соматостатина) на различные экспериментальные образцы (крысы с поврежденной печенью и поджелудочной железой). Повреждения достигали 24-часовым лигированием желчных протоков, 24-часовым лигированием желчных протоков + печеночной артерии, 48 ч ограничивающим стрессом, аппликацией CCl₄. Примененный пептид, вводимый в количестве от 10 мкг до 10 нг/кг массы тела внутрижелудочно или внутрибрюшинно, значительно предотвращал некроз печени и поджелудочной железы, а также жировое перерождение у животных, подвергнутых 24-часовому лигированию желчных протоков, 24-часовому лигированию желчных протоков + печеночной артерии, 48 ч ограничивающему стрессу, аппликации CCl₄. Биологические величины содержания билирубина, SGOT, SGPT полностью находятся в соответствии с указанными макро/микроскопическими данными.

2) Влияние на повреждение почек

а) Односторонняя нефрактомия.

В экспериментах использовали белых крыс Wistar с массой 190-250 г. Крысам была проведена односторонняя нефрактомия, в результате чего наблюдалось увеличение массы оставшейся почки у группы контрольных животных и группах животных, которым вводили внутрибрюшинно пептиды с посл. ид. N 2, 3, 4, 6 в количестве 10 мкг/кг массы тела за один час до операции. В группах животных, которым вводили пептиды, наблюдали уменьшение повышения массы оставшейся почки.

Были сравнены биохимические параметры обеих групп. Оказалось, что все применяемые пептиды улучшают функцию оставшейся почки.

b) Применение гентамицина.

В экспериментах применяли самок белых крыс Wistar. Повреждения канальцев индуцировали гентамицином, вводимым в количестве 40 мг/кг один раз в день в течение 30 дней. Всех животных вскрыли через 5 дней после последнего введения лекарственных средств. Значительные повреждения канальцев наблюдали в контрольной группе, тогда как меньшие микроскопические нарушения установлены во всех группах животных, которым вводили указанные выше пептиды.

c) Применение хлорида ртути.

Эксперименты проводили на белых крысах Wistar. Хлорид ртути вводили внутривенно в количестве 2 мг/кг массы тела. Пептиды с посл. ид. N 2, 3, 4, 6 вводили в количестве 20 мкг/кг до введения хлорида ртути. Подобным образом контрольные биохимические данные и микроскопические результаты показали наличие защитного эффекта в группах животных, которым ввели указанные пептиды.

3) Влияние на повреждение яичек

Влияние пептидов с посл. ид. N 2, 3, 4, 6 на повреждения яичек исследовали путем введения кетоконазола (24 мг/кг, внутрижелудочно), тестостерона (30 мг/кг, внутрибрюшинно) или 6Gy-облучением. За один час до введения такого соединения или облучения им вводили пептиды с посл. ид. N 2, 3, 4, 6. Эти пептиды показали защитное действие.

4) Влияние на репродуктивность/товарное животноводство.

а) Пептиды с посл. ид. N 2, 3, 4, 6 и репродуктивность. Влияние на олигоастеноспермис.

Исследования проводили на 10 мужчинах возраста 30-40 лет с диагнозом олигоастеноспермис. Эякулят брали у этих пациентов через 3-4 дня после абстиненции. После разжижения (30 мин) к 0,5 мл эякулята добавили 0,5 мл среды. Контрольная среда содержала HAM-F10 с 10% дезактивированной хордальной сыворотки. Экспериментальная среда содержала дополнительно 2 или 4 мкг/мл ВРС. После распространения в течение 90 мин при 37^oC в атмосфере, содержащей 5% CO₂, в камере репродуктивности Horwell определяли число подвижных, подвижных на месте и неподвижных сперматозоидов в 1 мл эякулята. Предварительные результаты показали отсутствие влияния на подвижность сперматозоидов указанных пептидов при их низких концентрациях. Однако при высоких концентрациях (4 мкг) отмечалось их существенное влияние.

b) Пептиды с посл. ид. N 2, 3, 4, 6 и репродуктивность.

Действие указанных пептидов исследовали на мышах с предыдущими тремя беременностями. Через 20 дней после прекращения последней лактации животных подвергали копуляции. Пептиды вводили в количестве 10 мкг/кг массы тела 1 раз в день в течение всего периода беременности (19-21 день) и лактации (следующие 3 неделе). Контрольная группа получала одновременно равный объем физиологического раствора. Регистрировали число потомства на каждую самку и массу потомства.

Тщательный статистический анализ показал значительное увеличение числа потомства на самку, а также, как сюрприз, отсутствие различия в массах тел в изучаемых интервалах времени. Все самки были оставлены для выздоровления в течение последующих 25 дней после прекращения лактации. Затем их снова копулировали для исследования влияния на пятую беременность. Повышенную скорость репродуктивности с повышенной способностью к лактации относительно контрольной группы наблюдали во всех группах животных, которым вводили указанные пептиды.

Следует отметить, что указанные пептиды могли повысить репродуктивность у совсем старых мышей. В заключение следует отметить, что эти результаты находятся в соответствии со способностью обычных полезных пептидов и данными, полученными in vitro c применением спермы человека.

c) Товарное животноводство.

1419 здоровых поросят (из общего количества 4306) получили 10 мкг пептидов с посл. ид. N 2, 3, 4, 6 сразу после рождения, другие 1440 поросят - на 13-й день жизни за 1 час до кастрации, остальные 1477 получили только обычную Fe-терапию. Ушибы, выбраковку, смертность, массу тела и расход кормов оценивали после 4-х недель. Применяемые пептиды, введенные один раз, значительно понижали скорость выбраковки (в группе, которой вводили пептиды сразу после рождения) и скорость получения травм (во всех группах животных, которым ввели пептиды). У животных, которым ввели пептиды, отмечены те же массы тела при заметном снижении расхода кормов. Влияние на инфицирование: исследовали сорок 28-дневных, отлученных от матки поросят, инфицированных энтероколитом E. coli. Пептиды вводили 20 животным (10 мкг/кг массы тела, межмышечно). Через один месяц было отмечено значительное снижение смертности у животных, которым ввели пептиды.

В другом эксперименте на 1200 здоровых поросятах исследовали скорость смертности после первой недели. 400 животных получили указанные пептиды сразу после рождения кроме обычной Fe-терапии. В группах животных, которым ввели эти пептиды (10 мкг/кг массы тела, межмышечно), наблюдали значительное снижение смертности.

5) Влияние на амфетамин.

Исследовали влияние пептидов с посл. ид. N 2, 3, 4, 6, введенных в количестве 10 мкг или 10 нг/кг массы тела внутрибрюшинно за 5 минут до введения амфетамина или одновременно с ним. В группах животных, которым вводили пептиды, отмечено значительное снижение нарушения поведения, вызванного амфетамином.

6) Влияние на время кровотечения.

Влияние пептидов с посл. ид. N 2, 3, 4, 6 исследовали обычными анализами на кровотечение (обрезание хвоста или инсизия) у мышей и крыс с применением гепарина (1000 м.е. подкожно за три часа до кровотечения) или без него. Исследованные пептиды (10 мкг или 10 нг/кг массы тела, внутрибрюшинно) вводили одновременно с индуцированием кровотечения. У всех животных, которым ввели изучаемые пептиды, обнаружили значительное уменьшение времени кровотечения.

7) Влияние на последствия кастрации.

Для исследования была разработана модифицированная методика Allen-Doisy. Животным вводили разные дозы (10 мкг или 10 нг/кг, внутрибрюшинно) пептида в одноразовом или ежедневном режиме введения как до, так и после кастрирования. В группах животных, которым вводили исследуемые пептиды, наблюдали предотвращение или реверсию различных последствий кастрации (например вагинальной эпителиальной атрофии, остеопороза).

8) Влияние на гипертензию.

Гипертензию индуцировали путем однобоковой окклюзии почечной артерии. Через 10 дней после индуцирования животным ввели пептиды с посл. ид. N 2, 3, 4, 6 (10 мкг или 10 нг/кг массы тела, внутрибрюшинно) или физиологический раствор, применяя различные режимы введения (одноразовый или непрерывный). В группах животных, которым вводили изучаемые пептиды, наблюдали значительное снижение величин повышенного кровяного давления.

9) Влияние на экспериментальный сахарный диабет

Для исследования влияния пептидов на индуцированный стрептоазотоцином или аллоксаном сахарный диабет применяли самцов белых крыс Wistar, имеющих массу тела 175-230 г. Пептиды с посл. ид. N 2, 3, 4, 6, введенные в количестве 10 или 100 мкг/кг, значительно задерживали начала развития диабета у животных, которым ввели стрептозотоцин. Кроме того, они значительно пролонгировали время выживания животных.

10) Влияние на тиреопаратиреоидэктомию.

Проводили общее удаление паращитовидных желез у крыс Wistar. Затем им вводили пептиды с посл. ид. N 2, 3, 4, 6 (10 нг/кг массы тела, внутрибрюшинно) или физиологический раствор (5 мл/кг массы тела внутрибрюшинно) с использованием различных режимов введения (однократно или многократно). У групп животных, которым ввели изучаемые пептиды, последствия удаления желез оказались уменьшенными.

11) Влияние на лигирование сонной артерии.

Животные были умерщвлены через 3 ч после лигирования обеих сонных артерий. За один час до этого всем животным ввели пептиды с посл. ид. N 2, 3, 4, 6 (10 нг/кг массы тела, внутрибрюшинно) или физиологический раствор (5 мл/кг массы тела, внутрибрюшинно). У группы животных, которым ввели пептиды, наблюдали меньший отек мозга.

12) Влияние на надпочечники.

Для индуцирования повреждения надпочечников животным вводили анилин (300 мг/кг массы тела, подкожно в течение 7 дней). Одновременно всем животным ввели пептиды с посл. ид. N 2, 3, 4, 6 (10 мкг/кг, 10 нг/кг массы тела, внутрибрюшинно) или физиологический раствор (5 мл/кг массы тела, внутрибрюшинно). Измеряли массу надпочечников и микроскопией определяли изменения. Исследуемые пептиды значительно снизили индуцированное анилином повышение массы надпочечников (при введении обеих доз препаратов) относительно контрольной группы. Защитное действие пептидов на надпочечники зависело от дозы пептидов. Поскольку общепринято, что индуцированные анилином нарушения связаны с гиперсекрецией адренокортикотропного гормона ((АКТГ), можно установить причинную связь между изучаемыми пептидами и АКТГ. Это положение можно также подтвердить обнаружением одинаковой массы тела у группы животных, которым ввели пептиды и контрольной группы здоровых животных.

Дополнительно животных подвергали сдерживающему стрессу в течение 48 ч после предварительного введения им исследуемых пептидов (10 мкг или 10 нг/кг массы тела, внутрибрюшинно/внутрижелудочно). Снижение повышенной массы надпочечников у животных с введенными изучаемыми пептидами согласовывалось с соответствующими микроскопическими наблюдениями.

13) Влияние на температурные нарушения.

Повышение температуры тела вызывали введением раствора дрожжей (400 мг/кг веса, подкожно), снижение температуры индуцировали погружением животных в холодную воду (4^oC) или введением резерпина (5 мг/кг, внутрибрюшинно). Исследование влияния пептидов с посл. ид. N 2, 3, 4, 6 (10 нг/кг массы тела, внутрибрюшинно) при различных режимах их введения на повышенную и пониженную температуры показало, что они нормализуют оба температурных нарушения.

14) Влияние на кроветворние.

Белым мышам инъекцией вводили цитостатические средства (эндоксан, винкристи, адриабластин, цитоарабинозид) в дозах LD₅₀ (доза, оказывающая воздействие у половины подопытных животных). За один час до введения цитостатического средства мышам вводили пептиды с посл. ид. N 2, 3, 4, 6 в количестве 10 мкг, тогда как контрольная группа мышей получала такой же объем физиологического раствора. Животных умерщвляли на 3-ий, 5-ый, 7-ой и 11-ый день после эксперимента. Определяли параметры крови (E, Hb, Hto, L, Tb, абсолютное число нейтрофилов), исследовали костный мозг, цитологию и гистологию печени и селезенки.

На третий день эксперимента различий между группами животных не наблюдали в значениях L, E, Tb и нейтрофилов. Напротив, здоровые кроветворные клетки костного мозга животных, которым ввели пептиды, сильно контрастировали с аплазией, наблюдаемой у контрольной группы животных.

Число нейтрофилов и лейкоцитов значительно повышались у животных, которым ввели пептиды, до 5-го дня, достигнув нормальных величин к седьмому дню, тогда как у контрольной группы не наблюдали нормализации до 11-го дня.

15) Влияние на уменьшение боли.

Боль индуцировали внутрибрюшинным введением (0,2 мл каждой мыши) 2%-ного раствора MgSO₄ или 0,6%-ной уксусной кислоты. Введение пептидов с посл. ид. N 2, 3, 4, 6 (10 мкг или 10 нг/кг массы, внутрибрюшинно) по различным схемам одновременно с индуцированием боли или через 30 мин привело к значительному снижению продолжительности боли по сравнению с контрольными группами животных.

16) Влияние на инфицирование риккетсиозом.

0,2 мл суспензии Coxielle Burnetti (растворена в 10-9-кратном объеме) вводили инъекцией в яйцеклетки. В эти же яйцеклетки вводили пептиды с посл. ид. N 2, 3, 4, 6 (1 пг, 10 пг, 100 пг и 1 нг). Время выживания было значительно больше, чем у контрольной группы.

17) Влияние на опухолевые клетки.

а) Две клеточные линии (L-924 и меланомы В-16) культивировали in vitro в стандартных условиях. Влияние пептидов с посл. ид. N 2, 3, 4, 6 на рост этих клеточных культур исследовали in vitro. Через 2 дня после инициирования культивирования в культуру добавили эти пептиды с концентрацией 3% (0,1 мл). Через 3 дня определяли счетчиком число клеток. Результаты подсчета показали ингибирующее действие этих пептидов на клетки меланомы В-16.

b) Опухоль асцитов Эрлиха (EAT) является опухолью, которая может расти на всех штаммах мышей, как в асцитной, так и в твердой форме, в зависимости от пути введения опухолевых клеток. Исследовали влияние инкубирования клеток EAT с пептидами с посл. ид. N 2, 3, 4, 6 на время выживания мышей, которым ввели эти клетки подкожно или внутрибрюшинно. Животных обследовали в течение периода 45 дней. Контрольная группа из 15 самцов мышей (штамм NMRI) получила 0,4х106 клеток EAT. До введения опухолевые клетки инкубировали в течение 1 ч. при 4^oC в физиологическом растворе. Объем инъекции составлял 0,2 мл. Среднее время выживания в этой группе было 35 дней и только 3/15 их выживали 45 дней.

Экспериментальной группе из 15 самцов мышей штамма NMRI ввели такую же дозу опухолевых клеток в том же объеме, но эти клетки предварительно инкубировали в растворе указанных пептидов (2 мкг/мл). Только 2/15 ч. этих мышей погибли в течение наблюдаемого периода (45 дней), тогда как все другие были живы в течение более 45 дней. Разница между контрольной и экспериментальной группами значительная (P<0,01). Такие же результаты наблюдали, если применяли ту же методику и EAT вводили внутримышечно (вместо подкожного введения).

c) Для исследования влияния пептидов с посл. ид. N 2, 3, 4, 6 (вводили в количестве 10 мкг/кг массы тела, внутрибрюшинно) на метастазы в легких, индуцированных инъекцией клеток меланомы или апластической карциномы молочной железы, применяли мышей. В группе мышей, которым вводили пептиды, наблюдали значительное снижение числа метастазов.

На основании описанных выше данных можно констатировать, что указанные пептиды пролонгировали время выживания животных с опухолями, обладая противоопухолевой активностью.

18) Антидепрессивная активность.

Для обнаружения антидепрессивной активности применяли тест на головокружение в соответствии с публикацией Porsolt at. al., Eur, J. Pharmacol, 47, 379-391, 1978.

Для этого эксперимента применяли самцов мышей Wistar (180-240 г). Изучаемый пептид с посл. ид. 4 вводили описанным методом. Говоря кратко, контрольных животных приводили в нормальное положение, определение проводили в течение 5 мин и подсчитывали время неподвижности. Время неподвижности у контрольных животных было 150 с, тогда как у животных, которым вводили пептиды, оно составляло только 60-70 с. Можно рассчитать следующий график чувствительности к дозам: 10 мкг - 10 нг/кг массы тела - полное воздействие, 10 пг - активность еще присутствует, 1 пг/кг - воздействие не наблюдается.

Результаты фармакологического исследования показывают, что эти пептиды защищают организм от стресса и заболеваний, в общем нормализуя органические функции.

Их можно также применять для предупреждения и лечения заболеваний и нарушений деятельности органов человека и животного. Более конкретно, эти соединения будут применять для лечения:

стресса, индуцированного нарушениями и болезнями, нарушения деятельности и повреждения печени и поджелудочной железы, атрофии яичек и подвижности спермы, нарушение фертильности, усовершенствования товарного животноводства, заболевания риккетсиозом, тиреопаратиреоидэктомии, сахарного диабета, нарушения деятельности надпочечников, нарушений в кроветворной системе, нарушения свертывания крови, нарушения кровотечения, послекастрационного/менопаузного нарушения, ишемических и токсических повреждений, психических нарушений, гипертензии, нарушений температуры тела, болевых ощущений, опухолей, депрессий.

В общем, описанные пептиды можно также применять в составе фармацевтических препаратов в сочетании с фармацевтическим носителем или средой, например наполнителем, нетоксичным буфером или физиологическим солевым раствором. Такие фармацевтические препараты можно применять местным или системным способом. Препараты могут быть в любой подходящей форме, например в виде жидкости, твердой или полутвердой форме, в виде инъекционного раствора, таблеток, мази, лосьона, капсул, в форме для подъязычного введения или другой подобной форме.

Эти пептиды будут применять в количестве от 10^-5 до 10^-2 мг/кг массы тела при системном введении. При местном введении их будут применять в большем количестве, например 0,1-0,5%.

Очень благоприятным для применения изучаемых пептидов является отсутствие любых симптомов токсичности при введении их до 50 мг/кг массы тела, а также высокая активность этих соединений при пероральном (внутрижелудочном) введении.

Описанные пептиды можно синтезировать ступенчатой конденсацией защищенных аминокислот в гомогенной жидкой системе или, что предпочтительно, в твердой фазе. Для синтеза циклических пептидов получают сначала частично защищенные линейные пептиды требуемой длины в виде алкилового эфира в С-концевой части молекулы, который превращают в азид. Азид затем подвергают циклизации, у продукта удаляют защитный радикал. По другому варианту частично защищенный линейный пептид со свободными концевыми группами циклизуют при помощи дифенилфосфорилазида в очень разбавленном растворе.

Далее изобретение поясняется в виде примеров, однако, объем настоящего изобретения не ограничивается приведенными примерами.

Пример 1. Синтез пептида с применением защитного радикала Boc.

Синтез пептида проводили, применяя 100 мгг Boc-Val-(ПАМ) полиакриламидной смолы для получения пептида с С-концевой карбоксигруппой (ПАМ приобрели у Applied Biosistems, замещение его составляет 0,56 мэкв/г аминополистеролом, замещенным аминоацил-4-(оксиметил)финилуксусной кислотой). Boc-аминокислоты (Boc-трет-бутоксикарбонил) конденсировали последовательно на полимерном носителе с применением диизопропилкарбодиимида в качестве конденсирующего средства. В каждой стадии Boc удаляли обработкой продукта 50%-ным раствором трифторуксусной кислоты (TFA) в дихлорметане. Аминогруппу затем депротонировали при помощи диизопропилэтиламина.

Превращение в каждой стадии должно быть выше 99,5%. Если превращение было недостаточно, его повторяли. После полного синтеза пептид отщепляли от носителя способом с низким содержанием HF (2 ч. при 0^oC). В качестве акцептора иона карбония применяли анизол. HF испаряли продуванием азота. Для выделения неочищенного пептида маслообразный остаток вылили в сухой диэтиловый эфир. Неочищенный пептид очищали хромотографией высокого разрешения (ЖХВР) с обращенной фазой с применением колонки размером 5х150 мм, заполненной силикагелем RP-18. Для градиентного элюирования применяли систему растворителей: 0,1%-ный раствор TFA в воде/ацетонитрил. Детектирование проводили по УФ-поглощению у 225 нм. Синтез пептида с посл. N 4 изображен на фиг. 1.

Пример 2. Синтез пептида с применением защитного радикала Fmoc.

Для синтеза применяли обычные Fmoc-защищенные аминокислоты (Fmoc-9-флуоренилметоксикарбонил). Боковые цепи защищали превращением в бутиловые эфиры (Asp, Apm, Glu, Aad) и Boc-производные (Lys). Первый аминокислотный остаток (Val) соединяли с полимерным носителем, в качестве которого применяли BHA-смолу (BHA-смола-бензгидриламиносмола) с использованием диизпропилкарбодиимида в качестве конденсирующего средства. На каждой стадии защитную группу Fmoc удаляли при помощи пиперидина. Затем вторую и все следующие аминокислотные остатки вводили таким же образом до окончания полного синтеза. Для отщепления пептида применяли смесь TFA/TFMSA/анизол в соотношении 2:17:52 (объем/объем).

Пептид затем очищали способом ЖХВР, описанным в примере 1. Синтез пептида с посл. ид. N 2 иллюстрируется на фиг. 2.

Пример 3. Синтез пептида с применением защитного радикала.

Все применяемые аминокислоты были защищены 3- -аминогруппы радикалом Ddz (Ddz - , -диметил-3,5-диметоксибензил-оксикарбонил). Боковые группы защищали радикалом Z (Z-бензилоксикарбонил) для лизина и трет-бутилом (трет-бутиловый эфир) для аспарагиновой и глутаминовой кислот. Носитель Morrifield (сшитый хлорметилированный гель полистирола) емкостью 1,4 ммоль/г применяли для связывания первой Ddz-кислоты через ее цезиевую соль. После конденсации с применением дициклогексилкарбодиимида (DCC) защитный радикал Ddz удаляли на каждой стадии 5%-ным раствором TFA в дихлорметане. Продукт затем промывали и депротонировали 10%-ным раствором триэтиламина в дихлорметане. После депротонирования проводили следующую стадию конденсации таким же образом. Эти стадии конденсации повторяли до получения целевой последовательности.

В конце синтеза пептид отщепляли от полимерного носителя при помощи смеси HBr /TFA/анизол. После испарения летучей части отщепленный пептид осаждали из сухого диэтилового эфира и сушили. Пептид затем очищали способом ЖХВР, описанным в примере 1.

Синтез пептида с посл. ид. N 6 иллюстрирован на фиг. 3.

Пример 4. Синтез циклического пептида.

Частично защищенный пептид формулы



предварительно получили способом, описанным в примере 1 или 2.

0,0005 молярной раствор этого соединения в диметилформамиде циклизовали после добавления дифенилфосфорилазида и триэтиламина при 25^oC в течение 12 ч.

Затем эту смесь гидрировали водородом с применением в качестве катализатора палладия на угле при 25^oC в течение 8 ч.

Растворитель осторожно удалили и продукт очищали способом ЖХВР, описанным в примере 1.

Циклический пептид с посл. N 10 формулы



был получен с выходом 10%.

Синтез линейных и циклических пептидов с применением защитного радикала.

Таким же образом с использованием защитных групп Ddz синтезировали линейные и циклические пептиды. Боковые группы защищали радикалом Z (остаток лизина) и бензиловой эфирной группой (остаток глутаминовой и аспарагиновой кислот). В качестве полимерного носителя применяли смолу HYCPAM^R (товарный знак ORPEGEN, Гейдельберг, Германия), которая является 4-бромкротонил- -аланиламидометилполистиролом. Первую аминокислоту (Ddz-валин) присоединили к полимерному носителю через ее цезиевую соль.

Затем радикал Ddz удаляли с применением трифторуксусной кислоты (5%-ной) в дихлорметане, аминогруппу депротонировали диизопропилэтиламином. На следующей стадии Ddz-глицин соединили с остатком валина на полимерной матрице с применением диизопропилкарбодиимида (DIPC) в присутствии 1-гидроксибензотриазола.

Эти стадии повторяли до получения целевого пептида. Синтезированный пептид в защищенной форме затем осторожно отщепляли от носителя тетракис-(трифенилфосфино)палладием (0), растворенным в безводном тетрогидрофуране в отсутствии кислорода. Дополнительно подобным образом морфолин применяли в качестве акцептора для аллильных групп.

Полимерный носитель отделили фильтрованием и промыли тетрагидрофураном. Раствор затем фильтровали через короткую колонку с силикагелем для удаления палладиевого катализатора.

Элюат, который содержит частично защищенный пептид с посл. 4а, сушили после выпаривания в вакууме растворителя.

Синтез линейного пептида с последовательностью 1с.

Частично защищенный пептид с последовательность 4а растворяли в 2,2,2-трифторэтаноле и гидрировали в присутствии палладия на угле (10%) водородом при 30^oC. Катализатор удалили фильтрованием, растворитель испарили в вакууме. Остаток затем очищали способом ЖХВР, как описано в примере 1. После очистки получили пептид с посл. ид. N 4. Продукт был идентичен с соединением, полученным в примере 1.

Синтез циклического пептида с посл. N 9.

Частично защищенный пептид с посл. 4а растворили в смеси диметилформамида и дихлорметана (1:) для образования 0,001-молярного раствора. Для циклизации добавляли DIPC и бутиловый спирт и смесь оставили стоять при 20^oC в течение 10 ч. Затем раствор концентрировали до небольшого объема, разбавили 2,2,2-трифторэтанолом и очищали пропусканием через колонку, заполненную сефадексом LH-20. Фракции, содержащие частично защищенный циклический пептид с посл. 9а, отбирали и гидрировали с применением палладия на угле (10%) в качестве катализатора при 30^oC пропусканием через систему водорода при интенсивном встряхивании в течение 8 ч.

Затем катализатор удаляли фильтрованием и фильтрат высушивали выпариванием растворителя в вакууме. Полученный пептид дополнительно очищали способом ЖХВР, описанным в примере 1. Чистый циклический пептид идентифицировали как пептид с посл. N 9.

Синтез на полимерном носителе HYCRAM проводили с использованием защитного радикала Ddz. Реакция циклизации иллюстрирована на фиг. 4 и 5. Все синтезированные пептиды проверены на чистоту способом ЖХВР с применением колонки с силикагелем RP-18 (октадецилсиланизированным). В качестве элюента использовали смесь растворителей, содержащую воду, ацетонитрил, трифторуксусную кислоту. Применяли обычное градиентное элюирование. Во всех случаях чистота была выше 95%.

Пептиды характеризовали аминокислотным анализом (полученные величины отличались от теоретических на 10%), анализом на аминокислотную последовательность, молекулярной массой, которую определяли FAB-масс-спектрометрией, УФ- и ИК-спектроскопией (фиг. 6 и 7).

Хотя только некоторые примеры согласно изобретения описаны в конкретных деталях, должно быть ясно всем, кто работает в этой области, что можно осуществлять на практике многие другие примеры изобретения и сделать много изменений. Существо и объем изобретения представлены в предлагаемой формуле изобретения.

Пример 5. Пептиды с последовательностью N 1, 3 и 5 очень похожи, и поэтому их синтезируют в соответствии с той же методикой, которая описана точно в примере 2, но используют для каждого пептида 1, 3 и 5 в соответствующей аминокислотной последовательности описанный порядок добавления защищенных аминокислот. Эти необработанные пептиды затем очищают, используя методику ЖХВД, описанную также в примере 1.

УФ- и ИК-спектры синтезированных пептидов с последовательностью N 1, 3 и 5 приведены на фиг. 8, 9 и 10.

Пример 6. Пептиды с последовательностью N 7, 8 и 11 имеют более короткую и похожую пептидную цепь и их синтезируют в соответствии с методикой, описанной в примере 1, но используют для каждого пептида 7, 8 и 11 в соответствующей аминокислотной последовательности описанный порядок добавления защищенных БОФ аминокислот. Эти пептиды затем очищают, используя методику ЖХВД, описанную в примере 1, УФ- и ИК-спектры синтезированных пептидов с последовательностью N 7, 8 и 11 приведены на фиг. 11, 12 и 13.

Для подтверждения п. п. 3, 5 и 7 заявитель дополнительно представляет необходимые УФ- и ИК-спектры пептидов с последовательностью N 2, 9 и 10 на фиг. 14-16.

Для подтверждения п. 12, относящегося к фармацевтической композиции, заявитель также представляет необходимые примеры.

Пример 7. Изготовление капсул. Капсулы, содержащие синтетические пептиды с последовательностью N (номеров) по настоящему изобретению, изготовляют в соответствии с методикой, уже известной в фармацевтической технологии.

Ниже описана композиция капсул, в которой используют в качестве примера пептид 2, но вместо него можно использовать любой из пептидов I - II:

Пептид с последовательностью N 2 - 0,05 мг

Лактоза - 99,0 мг

Стеарат магния - 0,5 мг

Итого - 100 мг

или:

Пептид с последовательностью N 2 - 0,3 мг

Пептид с последовательностью N 9 - 0,3 мг

Лактоза - 99,0 мг

Стеарат магния - 0,4 мг

Итого - 100 мг

В соответствии с данным методом, каждый пептид, синтезированный с использованием настоящего изобретения, может быть переработан в форму капсул.

Пример 8.

Изготовление таблеток.

Таблетки, содержащие синтетические пептиды по настоящему изобретению с последовательностью N 1-11, изготовляют в соответствии с обычной методикой, уже известной в фармацевтической технологии.

Композиция таблеток следующая, мг:

Пептид по настоящему изобретению - 0,5

Лактоза - 37,5

Крахмал - 6,0

Тальк - 3,0

Трагекант - 2,5

Стеарат магния - 0,5

Итого - 50

Пример 9. Изготовление крема

Крем, содержащий терапевтически активное количество пептидов с последовательностью N 1-11, изготовляют в соответствии с обычными методами фармацевтической промышленности.

Композиция крема следующая, г:

Пептид по настоящему изобретению - 2,5

Эмульгатор - 25,00

Гидрогенизированное арахисовое масло - 60,57

tween 60 - 131,60

Пропиленгликоль - 30,00

Метилгидроксибензоат - 0,16

Пропилгидроксибензоат - 0,17

Итого - 250

Пример 10. Изготовление раствора для инъекций

Раствор для инъекций, содержащий терапевтически активное количество синтетических пептидов с последовательностью N 1-11 по настоящему изобретению получают в соответствии с обычной методикой, уже известной в фармацевтической промышленности.

Композиция раствора такова, мг:

Пептид по настоящему изобретению - 0,3

Натриевая соль карбоксиметилцеллюлоза - 1,5

Поливинилпирролидон - 5,8

Лецитин - 2,7

Бензиловый спирт - 0,1

Буфер - Сколько понадобится

Дважды дистиллированная вода до конечного объема 1,0 м

Раствор фильтруют, стерилизуют и упаковывают в ампулы.

Пример 11. Изготовление твердых средств для введения

Композиция твердого средства для введения, мг:

Пептид с последовательностью N 2 - 0,3

Пептид с последовательностью N 9 - 0,3

Маннит - 10,0

Итого - 10,6

Неочищенные соединения растворяют в 1 мл дважды дистиллированной воды, стерильно фильтруют в пузырьки и лиофилизируют в вакууме.

В некоторых случаях может быть выгодно приготовить комбинацию двух пептидов с похожей активностью, но с различной протяженностью во времени терапевтического эффекта, для того, чтобы получить терапевтическую форму с продолжительной и однородной активностью.

Пептиды по настоящему изобретению исследовали на различных терапевтических моделях, используя внутрибрюшинный, внутривенный, пероральный и местный способ применения. Обычно для первоначальных исследований использовали стерильные фильтрованные растворы или крем.