способ определения активности столбнячного антитоксина в твердофазном иммуноферментном анализе

Классы МПК:G01N33/53 иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого
G01N33/543 с нерастворимым носителем для иммобилизации иммунологических материалов
Автор(ы):,
Патентообладатель(и):Научно-производственное объединение "Аллерген"
Приоритеты:
подача заявки:
1992-12-29
публикация патента:

Изобретение относится к медицинской иммунобиотехнологии и может быть использовано в производстве к при контроле препаратов, содержащих столбнячный антитоксин. Столбнячный антитоксин определяют в иммуноферментном анализе путем иммобилизации лиганда на полистироле с последующим инкубированием на нем испытуемой пробы, обработкой иммуноферментным конъюгатом и учетом результата колориметрированием. С целью повышения точности контроля гипериммунных сывороток и удобства осуществления способа,, инкубируют референтную сыворотку и разведения испытуемой пробы в присутствии столбнячного антигена, в качестве лиганда и иммунного агента конъюгата используют противостолбнячные антитела, а результат учитывают по формуле:

А = SТ,

где А - активность противостолбнячных антител в пробе, МЕ/мл;

S - специфическая активность референтной сыворотки, МЕ/мл;

Т - разведение испытуемой пробы, интерполированное для экстинкции референтной сыворотки.

4 ил., 2 табл.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5

Формула изобретения

Способ определения активности столбнячного антитоксина в твердофазном иммуноферментном анализе, предусматривающий иммобилизацию лиганда на полистироле с последующим инкубированием на нем испытуемой пробы, обработкой иммуноферментным конъюгатом и учетом результата колориметрированием, отличающийся тем, что инкубируют референтную сыворотку и разведения испытуемой пробы в присутствии столбнячного антигена, в качестве лиганда и иммунного агента конъюгата используют противостолбнячные антитела, а результат учитывают по формуле

A = ST,

где A - активность противостолбнячных антител в пробе, МЕ/мл;

S - специфическая активность референтной сыворотки, МЕ/мл;

T - разведение испытуемой пробы, интерполированное для экстинкции референтной сыворотки.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской иммунобиотехнологии и может быть использовано в производстве и при контроле препаратов, содержащих столбнячный антитоксин.

Известен способ определения активности столбнячного антитоксина в твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА), предусматривающий иммобилизацию лиганда - противостолбнячных антител - на полистироле с последующим внесением испытуемой пробы и иммуноферментного конъюгата (столбнячного анатоксина, меченного щелочной фосфатазой), инкубированием реакционной смеси и колориметрическим учетом результата с помощью калибровочного графика (H. Fey, G. Stiffler-Rosenberg. Messung von Tetanus-Antitoxin beim Pferd mit dem Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay. Schweizer Archiv fur Tierheilkunde, Bd. 119, H.11, S. 437-446, 1977).

Известен также способ определения активности столбнячного антитоксина в твердофазном ИФА путем иммобилизации столбнячного анатоксина на полистироловом планшете с последующим внесением и инкубированием испытуемой пробы, обработкой иммуноферментным конъюгатом (антителами к IgG человека, меченными щелочной фосфатазой) и колориметрированием с использованием калибровочного графика (Tetanus IgG EIA Test Kit with Microstrips. Labsystems, Finland, 1983).

Наиболее близким к заявляемому является способ определения активности столбнячного антитоксина в твердофазном ИФА, предусматривающий иммобилизацию лиганда - столбнячного токсина - на полистироловом планшете с последующим внесением и инкубированием испытуемой пробы, обработкой иммуноферментным конъюгатом (антивидовыми антителами или столбнячным токсином, меченными пероксидазой хрена) и учетом результата колориметрированием с использованием градуировочной кривой (патент ГДР N 275120, кл. G 01 N 33/543, приоритет 23.08.88).

Однако указанные способы обладают низкой точностью контроля гипериммунных сывороток, а используемые при этом антительные иммуноферментные конъюгаты должны быть видоспецифичными, что неудобно для пользователя.

Целью изобретения является повышение точности способа при контроле гипериммунных сывороток, а также удобства осуществления способа.

Указанная цель достигается тем, что в способе определения активности столбнячного антитоксина, предусматривающем иммобилизацию лиганда на полистироле с последующим инкубированием на нем испытуемой пробы, обработку иммуноферментным конъюгатом и колориметрический учет результата, инкубируют референтную сыворотку и разведения испытуемой пробы в присутствии столбнячного антигена, в качестве лиганда и иммунного агента конъюгата используют противостолбнячные антитела, а результат учитывают по формуле:

A = ST,

где

A - активность противостолбнячных антител в пробе, ME/мл;

S - специфическая активность референтной сыворотки, ME/мл;

T - разведение испытуемой пробы, интерполированное для экстинкции референтной сыворотки.

На фиг. 1 дана технологическая схема прототипного способа; на фиг. 2 - технологическая схема предлагаемого способа; на фиг. 3 - результаты контроля активности противостолбнячных антител в референтной и гипериммунных сыворотках; на фиг. 4 - кривая титрования к примеру 1.

Внесенные изменения поясняются технологическими схемами предлагаемого и прототипного способов (фиг. 1 и 2).

Нами установлено, что причиной погрешности способа является неизвестная ранее зависимость результатов ИФА от аффинности гипериммунной сыворотки. Эта зависимость проиллюстрирована на фиг. 3 графиками измерения экстинкции в ИФА для различных разведений референтной и испытуемых противостолбнячных гипериммунных сывороток, активности которых предварительно установлены референс-методом нейтрализации токсина на белых мышах (Методическое руководство по лабораторной оценке качества бактерийных и вирусных препаратов, М., 1972, с. 235-264). У каждого графика на фиг. 3 указаны константы аффинности К. Как видно из графиков, при твердофазном ИФА ошибка измерений минимальна и практически не зависит от аффинности в окрестности значения активности референтной сыворотки, относительно которого определяют активность проб в референс-методе (A= 0,1 ME/мл). Поэтому для повышения точности измерений необходимо либо вносить соответствующую поправку в результат по данным предварительного измерения аффинности, что практически невыполнимо, либо, как предлагается в настоящем способе, измерять экстинкцию для референс-сыворотки и ряда разведений испытуемой пробы с последующим интерполированием к значению экстинкции референс-сыворотки и расчетом искомой активности по формуле (1).

Использование в качестве лиганда противостолбнячных антител, как указано в приведенном выше обзоре аналогов, известно. В предлагаемом способе оно имеет новое назначение: обеспечивает возможность технического осуществления интерполяции результата в точке с минимальной погрешностью, что неочевидно, поскольку, как показали наши исследования, другие варианты ИФА, в частности, прямой конкурентный метод, при контроле гипериммунной сыворотки не обеспечивают стабильности измерений (коэффициент вариации способ определения активности столбнячного антитоксина в   твердофазном иммуноферментном анализе, патент № 2113713 > 20%).

Сочетание данного лиганда с используемым иммунным агентом конъюгата (противостолбнячными антителами) позволяет не только обеспечить высокую чувствительность способа, но и исключить требование видовой специфичности способа.

Пример. 96-луночный полистироловый планшет обрабатывают противостолбнячными лошадиными антителами в физиологическом растворе (концентрация антител 5 мкг/мл) из расчета 200 мкл/лунка, выдерживают в течение 16 ч при комнатной температуре и 3-кратно промывают 0,01 М фосфатно-солевым буферным раствором, дополнительно содержащим твин-80 (CNaCl=0,5 М; CТВИН=0,1%), pH 7,2 (ФСБ-Т).

Готовят рабочие растворы:

1) противостолбнячной стандартной сыворотки ГИСК (активность 4 ME/мл) в 40-кратном разведении (S=0,1 ME/мл);

2) испытуемой пробы противостолбнячной гипериммунной сыворотки в разведениях Т1=5000; Т2=10000; Т3=15000 и Т4=20000;

3) столбнячного анатоксина разведением в 500 раз концентрированного анатоксина с активностью 800 ЕС/мг при концентрации белка 0,5 мг/мл.

В лунки планшета с иммобилизованными противостолбнячными антителами вносят по 100 мкл разведений стандартной и испытуемой сывороток, а также физраствора, добавляют по 100 мкл разведения анатоксина и инкубируют в течение 16 ч при комнатной температуре. Далее планшет промывают, как указано выше.

Иммуноферментный конъюгат, содержащий противостолбнячные кроличьи антитела, меченные пероксидазой хрена, разводят ФСБ-Т до концентрации по пероксидазе 50 нг/мл и вносят по 200 мкл в лунки планшета. Планшет инкубируют 1 ч при 37oC и промывают, как указано выше.

В лунки вносят по 200 мкл субстратной смеси, включающей ортофенилендиамин (0,2 мг/мл) и перекись водорода (0,015%) в цитратном буфере (pH 4,5), и инкубируют при комнатной температуре в темном месте в течение 30 мин. Затем в лунки вносят по 50 мкл 50%-ной серной кислоты для остановки реакции.

Продукты реакции колориметрируют при способ определения активности столбнячного антитоксина в   твердофазном иммуноферментном анализе, патент № 2113713 = 492 нм . В данном примере экстинкция для пробы со стандартной сывороткой равна 0,910, а для физраствора - 1,767. Отношение экстинкций 0,910:1,767=0,51, что свидетельствует об оптимальном выборе рабочей точки измерений.

По результатам колориметрирования разведений испытуемой пробы строят кривую титрования в координатной плоскости E - lg T (фиг. 4). По кривой титрования определяют, что значению экстинкции референтной (стандартной) сыворотки E=0,91 соответствует разведение испытуемой пробы T=8000.

Согласно формуле (1), активность столбнячного антитоксина в испытуемой пробе составляет:

A=ST=0,1способ определения активности столбнячного антитоксина в   твердофазном иммуноферментном анализе, патент № 21137138000=800 ME/мл.

В табл. 1 приведены результаты определения активности пяти серий гипериммунных лошадиных противостолбнячных сывороток с различной аффинностью по данным 8 параллельных измерений предлагаемым, прототипным и прямым конкурентным способами ИФА, а также биологическим референс-методом. Как видно из таблицы, средние значения измерений предлагаемым способом соответствуют результатам референс-метода, но существенно (в 1,3-1,7 раза) отличаются от результатов, получаемых в прототипе и прямом конкурентном ИФА При этом по сравнению с референс-методом снижена вариация измерений, что подтверждается уменьшением погрешности среднего значения антитоксической активности. Эти выводы статистически значимы по критерию Стьюдента при p=0,05.

Помимо повышения точности, в предлагаемом способе не предъявляется требований к видовой принадлежности контролируемой сыворотки. Это вытекает из его технической сущности и дополнительно подтверждается табл. 2, где приведены результаты контроля противостолбнячных сывороток разной видовой принадлежности предлагаемым и прототипным способом (по 3 параллельных испытания). В табл. 2 лошадиная ферментированная сыворотка способ определения активности столбнячного антитоксина в   твердофазном иммуноферментном анализе, патент № 2113713 не имеет видовой принадлежности, что очевидно.

Поскольку известные способы определения активности противостолбнячных антител в гипериммунных сыворотках в ИФА имеют значительную погрешность, в СНГ единственным разрешенным в установленном порядке является вышеуказанный базовый биологический способ. По сравнению с этим способом отпала необходимость титрования на мышах в течение 4 сут, что не только ускоряет анализ (длительность предлагаемого способа 1 сут), но и удешевляет его. В этой связи на этапе испытания способа при контроле 1 тысячи проб экономия составила 47 тысяч рублей, что подтверждается актом испытания.

Класс G01N33/53 иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого

способ диагностики поражения вегетативных парасимпатических узлов головы вирусной этиологии -  патент 2529795 (27.09.2014)
способ диагностики поражения вегетативных парасимпатических узлов головы вирусной этиологии -  патент 2529794 (27.09.2014)
способ оценки острой соматической боли -  патент 2529793 (27.09.2014)
способ оценки эффективности противогерпетического действия фотодинамического воздействия на вирус простого герпеса (впг) in vitro -  патент 2529792 (27.09.2014)
способ прогнозирования самопроизвольного выкидыша -  патент 2529788 (27.09.2014)
способ идентификации вызывающих муковисцидоз мутаций в гене cftr человека, набор праймеров, биочип, набор мишеней и тест-система, используемые в способе -  патент 2529717 (27.09.2014)
способ прогнозирования инфекционного осложнения атопического дерматита у ребенка -  патент 2528908 (20.09.2014)
способ прогнозирования риска развития тяжелого поражения нервной системы у новорожденных детей с различным сроком гестации в неонатальном периоде -  патент 2528907 (20.09.2014)
способ получения иммуносорбента для диагностики вируса простого герпеса 1 типа -  патент 2528896 (20.09.2014)
способ прогнозирования развития психической дезадаптации -  патент 2528886 (20.09.2014)

Класс G01N33/543 с нерастворимым носителем для иммобилизации иммунологических материалов

способ получения иммуносорбента для диагностики вируса простого герпеса 1 типа -  патент 2528896 (20.09.2014)
способ детекции аналита из раствора на частицах и устройство для его реализации -  патент 2528885 (20.09.2014)
вращающееся магнитное поле для улучшенного детектирования при анализе кластеров -  патент 2528102 (10.09.2014)
иммунологический тест для определения аутоантител против антигенов семенников -  патент 2528060 (10.09.2014)
устройство для анализов и способ выполнения биологических анализов -  патент 2527686 (10.09.2014)
возбуждение магнитных шариков с использованием обратной связи для биосенсора на основе нпво -  патент 2526198 (20.08.2014)
магнитоуправляемый сорбент для удаления билирубина из биологических жидкостей -  патент 2524620 (27.07.2014)
приведение в действие импульсным магнитным полем для чувствительных анализов -  патент 2520607 (27.06.2014)
система биосенсора для приведения в действие магнитных частиц -  патент 2519655 (20.06.2014)
способы определения эффективности лиганда натрий-протонного антипортера -  патент 2519345 (10.06.2014)
Наверх