способ получения простагландинов из медицинской пиявки

Формула изобретения

Способ получения простагландинов из медицинской пиявки, включающий гомогенизацию пиявок, экстрагирование гомогената, отделение надосадочной жидкости, отличающийся тем, что водный раствор гомогената или порошка лиофильно высушенных пиявок прогревают в кипящей водяной бане не менее трех минут, центрифугируют, проводят гидролиз полипептидных компонентов надосадочной жидкости, экстрагируют органическими растворителями, собирают жирорастворимую фракцию и упаривают до сухового остатка.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения биологически активных препаратов, и может быть использовано в гематологии, биотехнологии, медицинской промышленности, ветеринарии.

Известен способ получения стабильного аналога простациклина бактериальной природы, взятый в качестве прототипа [1].

Он включает забор крови из медицинской пиявки, инкубирование ее в питательной среде, пересев выросших колоний бактерий, собирание клеток, разрушение ультразвуком суспензированных в дистиллированной воде клеток, диализ недостаточной жидкости.

Но данный способ имеет следующие недостатки: он трудоемок, требуется много времени на его осуществление, конечный продукт, получаемый данным способом, неоднороден, т.е., простагландины получают не в гомогенном состоянии.

Целью изобретения является сокращение времени получения простагландинов, снижение трудоемкости способа и получение простагландинов в гомогенном состоянии.

Поставленная цель достигается тем, что водный раствор гомогената или порошка лиофильно высушенных медицинских пиявок прогревают в кипящей водной бане не менее 3 мин, центрифугируют, проводят гидролиз полипептидных компонентов надосадочной жидкости, экстрагируют органическими растворителями, собирают жирорастворимую фракцию и упаривают ее до сухого остатка.

Пример 1. Готовят водный экстракт Пиявита /лиофилизированного порошка медицинских пиявок/: 100 мг Пиявита суспендируют в 4 мл H₂О, инкубируют 30 мин при 37^oC, центрифугируют при 2000 об/мин в течение 20 мин (или фильтруют через бумажный или ватно-марлевый фильтр). Надосадочную жидкость помещают в кипящую водяную баню на 10 мин. В остывший до комнатной температуры раствор вносят трипсин и химотрипсин в конечной концентрации 10 мг/мл при pH 8,0 и оставляют на 10 ч (ферментативный гидролиз). По окончании инкубации экстрагируют этилацетатом в течение 20 мин при постоянном встряхивании, собирают органическую фракцию и упаривают ее до сухого остатка.

Для тестирования активности сухого остатка суспензируют его в H₂O дист. при pH 8,0 - 8,5. Центрифугируют и анализируют надосадочную жидкость. Конечный продукт не содержит полипептидных цепей и аминокислот (отрицательные спектрофотометрический и нингидриновый тесты). Содержит простагландины в количестве 25,0 нг/мл и блокируют агрегацию тромбоцитов, стимулированную АДФ на 100%.

Пример 2. Берут 20 медицинских пиявок, измельчают в гомогенизаторе, экстрагируют дист. H₂О и центрифугируют. Надосадочную жидкость помещают в кипящую водяную баню на 5 мин. В охлажденный до комнатной температуры раствор вносят едкий натр (NaOH) до конечной концентрации 2H, инкубируют в течение 12 ч (щелочной гидролиз).

В раствор вносят двукратный объем хлороформа и экстрагируют 20 мин при постоянном встряхивании. Собирают органическую фракцию и упаривают ее до сухого остатка.

Сухой остаток растворили в 0,5 М фосфатном буфере pH 7,5. Конечный продукт не содержит и лиопептидных цепей и аминокислот (отрицательные спектрофотометрические и нингидриновый тесты), содержит ппростагландины в количестве 23,0 нг/мл и блокирует агрегацию тромбоцитов, стимулированную АДФ, на 100%.

При прогревании надосадочной жидкости в кипящей водной бане менее 3 мин получают конечный продукт с низким содержанием простагландинов, что объясняется тем, что большая часть простагландинов находится в связанном состоянии с белками дистабилазного комплекса, обеспечивая им термостабильность и защиту от гидролитического действия трипсина и химотрипсина. Таким образом, большая часть простагландинов остается в водной фракции после экстрагирования этилацетатом, поскольку связаны они с неуспевшими денатурироваться за такое время кипячения белками дистабилазного комплекса.

Методы тестирования содержания и активности простагландинов, выделенных из медицинских пиявок.

1. Количественный метод: используют набор реактивов для радиоимунологического анализа.

2. Качественный метод: ингибирование агрегации тромбоцитов. Готовят плазму крови (теплокровных животных), богатую тромбоцитами [1, 2], для чего цитратную кровь центрифугируют в течение 10 мин при 500 об/мин, собирают плазму, богатую тромбоцитами. Далее цитратную кровь центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин, собирают плазму, лишенную тромбоцитов, которую используют в качестве фоновой крови при спектрофотометрическом определении агрегации тромбоцитов при длине волны 600 нм по методу Борна [2].

Предлагаемый способ достаточно прост и позволяет получить простагландины в чистом виде.

Источники информации, принятые во внимание

1. Авт. св. 1473136, кл. A 61 K 35/14.

2. Лейтин В.Л., Свиридов Д.Д. Модельная система для изучения взаимодействия тромбоцитов с клеточными макромолекулярными компонентами сосудистой стенки in vitro. В кн.: Стенка сосудов в атеро- и тромбогенезе, М, 1983, 155 - 175.

3. Hutton R. A., Howard M.A., Deykin D., Hardisty R.M. Methods for the separation of platelets from plasme. Thromb. Diath. Haemost., 31, 119 - 132, 1974.

4. Born G. V., Grese H.J. Aggregation of blood platelets. J. Physiol., 168, 178 - 188, 1963.