способ определения гликолизированного гемоглобина в присутствии негликолизированного гемоглобина, аналитический тестовый набор

Формула изобретения

1. Способ определения гликолизированного гемоглобина в присутствии негликолизированного гемоглобина в образце крови дигидроксиборильным реагентом, отличающийся тем, что способ включает гемолиз образца для выделения клеточносвязанного гемоглобина до или одновременно с контактированием указанного образца с сигналобразующими молекулами, включающими конъюгат одного или более дигидроксиборильных остатков или их солей с сигналобразующей меткой, причем метка является колориметрической, флуоресцентной, радиоактивной, ферментной или хемилюминесцентной, отделение гликолизированного и негликолизированного гемоглобина и любых связанных с ним молекул из реакционной смеси, определение указанных сигналобразующих молекул, которые связаны с отделенным гемоглобином и/или любыми негемоглобинсвязанными сигналобразующими молекулами.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сигналобразующая молекула является неиммобилизованной.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что стадии контактирования и отделения выполняют одновременно.

4. Способ по любому из пп.1 - 3, отличающийся тем, что дополнительно определяют количество гликолизированного и негликолизированного гемоглобина из образца.

5. Способ по любому из пп.1 - 4, отличающийся тем, что указанный гликолизированный и негликолизированный гемоглобин выделяют селективным осаждением из гомогенного раствора.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что полученный осадок отделяют хроматографически или фильтрованием.

7. Способ по п.5, отличающийся тем, что стадию осаждения проводят на или в пористой твердой фазе, такой как хроматографическая или фильтрующая среда.

8. Способ по п.6 или 7, отличающийся тем, что хроматографическая или фильтрующая среда содержит один или более реагентов, выбранных из гемоглобиносаждающих агентов, сигналобразующих молекул, гемолизирующих агентов или комплексообразующих агентов.

9. Способ по любому из пп.5 - 8, отличающийся тем, что гемоглобин осаждают путем добавления ионов цинка, и/или ионов меди, и/или других специфических катионов металлов, осаждающих гемоглобин.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что дополнительно добавляют металлкомплексобразующий агент.

11. Способ по любому из пп. 1 - 8, отличающийся тем, что гемоглобин осаждают путем добавления органического растворителя или смеси органических растворителей в концентрации, которая способна специфически осадить гемоглобин.

12. Способ согласно п.11, отличающийся тем, что указанный растворитель выбирают из смешивающихся с водой спиртов, кетонов, простых эфиров, амидных растворителей, сульфоксидных растворителей, углеводородных растворителей, галогенированных растворителей или их смесей.

13. Способ согласно любому из пп.1 - 8, отличающийся тем, что гемоглобин осаждают путем добавления гемоглобинспецифичных связывающих протеинов.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что гемоглобин осаждают антигемоглобиновыми антителами или гаптоглобинами, или их фрагментами, необязательно в присутствии вторичных антител или антигаптоглобиновых антител или их фрагментов.

15. Способ по любому из пп.1 - 4, отличающийся тем, что гемоглобин выделяют посредством гемоглобинспецифичных связывающих белков, иммобилизованных на твердой фазе.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что сигналобразующие молекулы метят нещелочной фосфатной энзимной меткой.

17. Способ по любому из пп.1 - 16, отличающийся тем, что его осуществляют в присутствии конкурирующего агента, в частности, диолсодержащего соединения или соединения, содержащего дигидроксиборильный остаток.

18. Способ по любому из пп.1 - 17, отличающийся тем, что гемолиз проводят посредством гипотонического лизиса путем добавления детергентов или гуанидина, нагревания, воздействия ультразвука или посредством любой комбинации этих средств.

19. Способ по любому из пп.1 - 18, отличающийся тем, что сигналобразующие молекулы метят посредством N-(резоруфин-4-карбонил)-пиперидин-4-карбоновая кислота-N-гидроксисукцимидного сложного эфира (RESOS) или другими оксазинами.

20. Способ по любому из пп.1 - 19, отличающийся тем, что один или более из используемых реагентов, кроме тестируемых образцов, подвергают операциям, уменьшающим количество молекул, реакционноспособных в отношении дигидроксиборильных остатков.

21. Аналитический тестовый набор, состоящий из реагента, включающего сигналобразующую молекулу, содержащую коньюгат одного или более дигидроксиборильных остатков или их солей, связанный с сигналобразующей молекулой, и средства для отделения гемоглобина от образца необязательно в комбинации с буферными солями или растворами.

22. Набор по п.21, отличающийся тем, что средство для отделения гемоглобина выбирают из ионов цинка, и/или ионов меди, и/или других осаждающих гемоглобинспецифичных металлических катионов, органических растворителей или смеси органических растворителей, способных осаждать гемоглобин, или гемоглобинспецифичные связующие белки или их фрагменты необязательно иммобилизованные на твердом носителе.

23. Набор по п.21, отличающийся тем, что содержит ионы цинка или другого гемоглобиносаждающего металла в качестве реагента, отделяющего гемоглобин, и дополнительно содержит комплексобразующий агент.

24. Набор по пп.21 - 23, отличающийся тем, что указанный реагент и/или средство для отделения гемоглобина введены или нанесены на твердую фазу хроматографической или фильтрующей среды.

25. Набор согласно п.21, отличающийся тем, что дополнительно содержит твердую фазу хроматографической или фильтрующей среды для отделения осажденного гемоглобина.

26. Способ по любому из пп.1 - 20, отличающийся тем, что его используют для ин витро диагностики или мониторинга диабета.

Приоритет по пунктам:

11.05.89 по пп.1 - 8, 10 - 11, 13 - 22, 24 - 26;

04.01.90 по пп.9, 12, 23.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к лигандо-связывающему анализу, предназначенному для специфической оценки гликозилированного гемоглобина.

Протеины в растворе жидкостной среды организма постоянно подвергаются процессам гликозиляции. Глюкоза реагирует с протеинами в результате неэнзимных реакций с образованием гликопротеинов и в большинстве случаев уровень образования гликопротеина пропорционален концентрации глюкозы в рассматриваемой жидкостной среде организма. Поэтому в случае протеинов, первоначально не синтезированных в виде гликопротеинов, часть протеина, присутствующего в гликозилированной форме является функцией

- время жизни протеина в организме и

- концентрации глюкозы, которой был экспонирован протеин.

Измерения концентраций глюкозы в крови, плазме или моче дают информацию только относительно концентрации глюкозы во время отбора образцов, тогда как количество протеина, присутствующего в гликозилированной форме, является указанием на регулирование концентрации глюкозы организмом в ходе длительных периодов времени.

Эритроциты (красные кровяные клетки) имеют среднее время о жизни примерно 120 дней и содержат большие количества гемоглобина. Таким образом, доля эритроцитного гемоглобина в гликозилированной форме представляет собой хорошую меру контроля заболевания у пациентов с сахарным диабетом и является функцией концентраций глюкозы в крови пациента в течение недель до взятия образцов крови.

В клинической практике использовались многочисленные различные измерения доли гликозилированного гемоглобина с целью количественной оценки длительного контроля за глюкозой в крови пациента с сахарным диабетом. Основные методы, используемые в клинических условиях, представляют собой следующее.

1. Разделение гликозилированного и негликозилированного гемоглобинов с помощью ионно-обменной хроматографии. Эти операции представляют собой первый из предложенных методов и все еще являются наиболее распространенным клиническим методом.

Недостатками таких методов является высокая стоимость и длительность методов производства, а также длительность разделения, причем результаты такого метода зависят от небольших температурных изменений.

2. Использование производных борной кислоты для специфического выделения гликозилированной гемоглобиновой фракции. Давно известно, что фрагменты борной кислоты связываются с фрагментами карбогидратов, имеющими цисдиольные остатки (Дж. Боэсекен. Успехи химии карбогидратов, 4, 189-210, 1941. Дж. Солмс, Х.Дьюэл, С. 11, 311, 1957) и такое свойство может быть использовано в качестве основы разделения хроматографией по сродству. Так, например, остатки борной кислоты были химически иммобилизованы на такой твердой фазе, как агароза, для выделения гликопротеинов, карбогидратов и нуклеотидов (Хагеман Дж., Кюн Г. A al B oc e, 80, 547, 1977). Колонки с таким материалом были также использованы для количественного определения гликозилированной части гемоглобина (П.Д.Г. Дин с сотр., заявка на патент Великобритании CB-A-2024829. Такие колонки требуют больших затрат времени и дороги в изготовлении, а также в эксплуатации: Гемолизат должен быть пропущен через колонку, различные фракции должны быть собраны, а их объемы скорректированы перед тем, как можно будет измерить содержание в таких фракциях гемоглобина и рассчитана доля гемоглобина в гликолизированной форме.

3. Электрофоретическое разделение. -Гликозилирование гемоглобина изменяет электрический заряд протеина и это явление может использоваться для разделения гликозилированной и негликозилированной фракцией электрофоретически, после чего различные фракции могут быть подвергнуты количественному анализу, например, с помощью рефлектометрии. Такой метод также длителен и дорог.

Помимо гликозилирования гемоглобина внутри эритроцитов, гликозилирование протеинов сыворотки также может осуществляться с повышенной скоростью у пациентов, страдающих сахарным диабетом. Однако в связи с тем, что различные протеины сыворотки имеют различные периоды полураспада в организме пациента и большинство значений такого полураспада значительно короче, чем у гемоглобина измерения гликозилированных протеинов сыворотки используются лишь в течение промежутков времени от короткого до промежуточного, с целью слежения за протеканием заболевания. Различные колориметрические методы количественного анализа гликозилированных протеинов сыворотки широко используются в качестве индекса контроля диабета (Джонсон, Меткаф и Бакер, Clinical Chimica Acta, 127 /1982/, 87-95). Однако количественный анализ гликозилированных протеинов сыворотки имеет ограниченное клиническое значение из-за коротких времен полураспада большинства протеинов сыворотки, что в равной мере справедливо и в отношении гликозилированной формы. Более того, с технической точки зрения количественный анализ карбогидратов, связанных с протеинами сыворотки, требует сбора и приготовления сыворотки, что является длительной и сложной операцией (включающей пункцию вены, коагуляцию в течение 2 ч., центрифугирование и декантацию) по сравнению с определением глюкозы крови у диабетиков, которое может осуществляться отбором микрообразцов только капиллярной крови

Ни один из известных способов количественного определения гликозилированного гемоглобина не был использован в качестве абсолютного стандартного метода. В одних случаях фракции, выделенные различными известными методами, не точно соответствуют друг другу ("Измерение гликозилированных гемоглобинов с использованием хроматографии по средству", Бюриотис с сотр., Диабетология, 21: 579-580, 1981). В ионообменных методах фракция, названная HBAlc, часто определяется, как "гликозилированный гемоглобин". Однако, такая фракция может также содержать негликозилированные гемоглобины и некоторые гликозилированные гемоглобины элюируются в различных фракциях.

С помощью хроматографии по средству с использованием остатков иммобилизированной борной кислоты выделяют гемоглобины, гликозилированные по различным участкам, включая, например, гемоглобин, гликозилированный по остаткам лизина, помимо более традиционной фракции гликозилированной по аминоокончанию - цепочки. Однако негликозилированные гемоглобины могут оказаться неспецифически связанными с твердой фазой, используемой в таком методе и не весь гликозилированный гемоглобин может быть связан, если гликозильные фрагменты находятся внутри молекулы и не доступны для связывания твердыми фазами. В связи с этим различные методы количественного определения гликозилированных гемоглобинов, которые используются на практике, имеют различные значения ссылочного интервала.

Другая проблема состоит в том, что в некоторых методах высокие значения содержания глюкозы будут препятствовать количественному определению гликозилированной части.

Помимо указанной гликозилированной части гемоглобинов, в которых глюкоза ковалентно связана с гемоглобином, имеется другая гликозилированная часть, в которой глюкоза связана более свободно. На такие гликозилированные гемоглобины часто ссылаются, как на "лабильные" гликогемоглобины, поскольку реакция их образования может быть обратимой в результате промывки эритроцитов или инкубации эритроцитов в свободном от карбогидратов растворе, или в результате экспонирования гликозилированных гемоглобинов средой с pH 5 (Биссе, Бергер, и Флюкингер, Диабет, 31: 630-633, 1982). Однако геометрическая структура образовавшихся борных эфиров гликозилированного гемоглобина образуется, главным образом, с необратимо гликозилированными формами, а не с лабильными прегликозилированными формами.

Что касается альтернативных форм анализа, то иммобилизация антител на твердых фазах часто используется в методах иммунного анализа, а также в методах иммунной очистки протеинов и клетки. Антитела могут также использоваться в гомогенных иммуноанализах, т.е. в тех случаях, когда антитела и антигены присутствуют в растворе, и в тех случаях, когда реакция антитело/антиген может измеряться непосредственно (например, методами нефелометрии или турминометрии), или косвенно (с помощью флуоресценции или активации, либо ингибирования энзимами). Были предприняты многочисленные попытки для использования моноклональных или поликлональных антител, специфичных в отношении гликозилированного гемоглобина, однако лишь с ограниченным успехом. Это, главным образом, связано с тем, что большая часть карбогидратных остатков гликозилированного гемоглобина отсутствует в химических формах, трудно доступных для связывания моноклональными антителами. Таким образом, денатурация гликозилированного гемоглобина часто необходима для достижения такого связывания, например, путем абсорбции на поверхности полистирола (Энгбаек Ф., с сотр. : Клиническая химия, 35: 93-97, 1989) или с помощью химической денатурации (Новлес с сотр.: патент США N 4.658.022, 1987).

Дж. Вернет с сотр. (Biochemical und Bioph. Res. Com. т. 96, стр. 157-162, 1980) синтезировали флуоресцентную молекулу борной кислоты N-(5-диметиламино-1-нафталин сульфонил)-3-аминобензол борную кислоту, которая, как было показано, связывается с клеточными мембранами с целью флуоресцентной микроскопии клеток.

Флуоресцентные и окрашенные конъюгаты борных кислот, предназначенные для количественного определения общего количества гликозилированных протеинов, присутствующих в образце, были описаны Шлейсером в заявке на патент ФРГ DE 3720736, опубликованной 5 января 1989 г. Метод Шлейсера базируется на одном из трех следующих принципов измерения общего количества гликопротеинов, присутствующих в образце:

1) сдвиге абсорбционного максимума конъюгата борной кислоты при связывании с гликозилированными фрагментами гликопротеинов, или

2) поляризационном изменении флуоресценции при связывании флуоресцентного конъюгата борной кислоты с гликозилированными фрагментами присутствующих гликопротеинов, или

3) Измерении количества окрашенного или флуоресцирующего конъюгата борной кислоты, связанного с гликопротеином, присутствующим в системе после удаления избытка несвязанного конъюгата борной кислоты с использованием, например, активированного угля.

Однако ни один из методов, описанных Шлейсером (там же), не может использоваться для количественного определения специфического гликопротеина в смеси с другими гликопротеинами и особенно в целях специфического определения гликозилированного гемоглобина в образцах гемолизата, взятого у пациента. Кроме этого, реагенты, описанные Шлейсером, имеют относительно низкие абсорбционные коэффициенты и их максимумы поглощения находятся вблизи соответствующих максимумов гемоглобина, что затрудняет или делает невозможным детекцию гликозилированного гемоглобина даже в том случае, когда он присутствует в чистом виде. Разумеется, Шлейсер не упоминает об использовании своего метода для анализа гликозилированного гемоглобина, а вместо этого предлагает анализ гликозилированных протеинов сыворотки и гликозилированного албумина, экстрагированного из сыворотки человека.

Исследовали также пектины, реакционноспособные в отношении глипопротеинов, однако, до настоящего времени не было обнаружено пектинов, специфически реагирующих с гликозилированными гемоглобином и используемых для количественного анализа гликозилированных гемоглобинов.

Анализ на гликозилированный гемоглобин, основанный на мечении гликозилированной части с использованием производных борной кислоты и выделении гемоглобина из образца, из иммобилизованных гемоглобин связанных протеинов, описан в заявке на патент США N 4861728 (Вагнер), опубликованной после ранней даты приоритета настоящей заявки. В FP-A-2464475 (Амикон) описывается анализ на гликопротеин, подходящий для определения гликозилированные гемоглобина в образце, в котором реагенты на основе борной кислоты используются для выделения гликозилированной части из образца с последующим количественным анализом такой Франции.

В связи с этим существует потребность в улучшенном способе анализа гликозилированного гемоглобина, являющемся специфическим, быстрым, простым в использовании и легко приспосабливаемым для использования в клинических лабораториях.

Мы обнаружили, что в результате объединения разделения гликозилированной и негликозилированной частей гемоглобина из образца со специфическим карбогидрат, распознающим свойством производных борной кислоты детектировать лишь гликозилированную часть, может быть разработан эффективный и специфический метод анализа.

Согласно одному из аспектов настоящего изобретения, предусматривается способ оценки в образце количества гликозилированной части гемоглобина, включающей:

a) необязательный гемолиз образца с целью высвобождения клеточно связанного гемоглобина; b) контактирование указанного образца или гемоглобина, выделенного из такого образца, согласно стадии (c) с сигналобразующими молекулами, включающими конъюгат одного или более дигидроксиборальных остатков или их солей, связанный с сигналобразующей меткой;

c) выделение гликозилированного и негликозилированного гемоглобина и любых связанных с ним молекул из образца или реакционной смеси со стадии (b); и

(d) оценку указанных сигналобразующих молекул, которые связаны с выделенным гемоглобином и/или любым негемоглобином, связанным с сигналобразующими молекулами.

Помимо определения уровня содержания гликозилированного гемоглобина в образце, при осуществлении метода настоящего изобретения может быть желательным получать оценку уровня содержания гликозилированного и негликозилированного гемоглобина и расчитать соотношение между гликозилированным и общим гемоглобином.

Стадия выделения гемоглобина не требует выделения общего количества гемоглобина (гликозилированного и негликозилированного), присутствующего в образце. В случае соответствующей калибровки такого метода достаточно разделить лишь часть гликозилированной и негликозилированной фракций. Такие калибровки общеприняты в клинических лабораторных анализах.

Используемый в тексте термин "оценка" относится как к количественному определению в смысле получения абсолютного значения гликозилированного или общего гемоглобина в образце, так и К определению индекса, соотношения, процентного или другого указания на уровень содержания гликозилированного гемоглобина, например, по отношению к общей концентрации гемоглобина в образце.

Следует иметь в виду, что новый способ настоящего изобретения позволяет избежать разделения гликозилированной и негликозилированной фракций гемоглобина, а основывается вместо этого на выделении гликозилированного и негликозилированного гемоглобина из образца. Следовательно, нет необходимости в иммобилизации сигналобразующих производной борной кислоты, поскольку они не используются в качестве части разделительной системы и, разумеется, что предпочтительно, чтобы они не были иммобилизованны.

Способ настоящего изобретения может использоваться для оценки количества гликозилированного гемоглобина в образцах крови, гемолизатов крови или экстрактов крови, взятых у здоровых пациентов, или пациентов, страдающих от сахарного диабета или с симптомами такого заболевания. Этот метод особенно полезен для оценки гемоглобина в крови, или гемолизата, либо других смесях, включающих другие гликозилированные протеины и/или гликопротеины и/или карбогидраты, помимо гликозилированного гемоглобина. Перед анализом такие образцы могут находиться в сухой, жидкой или замороженной формах. Гемолизы для анализа по методу настоящего изобретения могут быть приготовлены, например, с использованием различных видов реагентов, с целью гемолиза и экспонирования карбогидратных фрагментов гликозилированных гемоглобинов в реакциях связывания. Такая обработка может осуществляться до или в комбинации с использованием других реагентов, необходимых для осуществления такого способа. С целью необязательного снижения интерференции образцы могут быть обработаны с целью понижения уровней содержания свободной глюкозы и/или лабильных гликогемоглобинов, например, с использованием оксидазы глюкозы или буферного раствора с pH ниже 6.

В способе настоящего изобретения реакция сигналобраэующей молекулы или конъюгатов с гемоглобинами может иметь место до или после выделения гемоглобина из образца. Выбранный порядок зависит от химического оборудования или инструментов, используемых для существования такого способа и того, что будет расценено, как более практическое решение.

Согласно одному из предпочтительных воплощений изобретения связывание сигнала-образующей молекулы и выделение гемоглобина осуществляется одновременно в гомогенном растворе, из которого гемоглобин осаждается и выделяется центрифугированием или фильтрацией. Однако, условия проведения реакции и выделения должны выбираться в рамках значений констант ассоциации в системе гликозильный остаток - борная кислота, которые достаточно низки (10^-3 - 10⁵ моль^-1, п).

Из величины сигнала, полученного от указанных сигнал-образующих молекул, может быть определена концентрация сигналобразующих молекул, связанных с гемоглобином или выделенных с ним. Как отмечалось выше, до настоящего времени не существует "абсолютного" стандарта для количественной оценки гликозилированного гемоглобина. Однако, если желательно, то может быть получена желательная калибровка или корреляция такого нового способа с известными методами с использованием стандартных гемоглобильных растворов, содержащих известные концентрации гликозилированного гемоглобина, определенные с помощью известных методов.

Образующие сигналы молекулы и конъюгаты могут традиционно включать остатки фенилборной кислоты, связанные с сигналобразующей меткой непосредственно, посредством аминной или амидной связи или с помощью химической связи любого вида известного из литературы, в результате чего дигидроксиборильные остатки остаются свободными и способны реагировать с цисостатками гликозильных фрагментов гемоглобина. В зависимости от желательного значения pKa для остатков борной кислоты фенильное кольцо может быть дополнительно замещено, например, нитро, формильной или алкокси группами или другими заместителями, которые влияют на значение pKa, но не оказывают стерического препятствия связыванию с цисдиольными остатками гликозилированных гемоглобинов.

Остатки борной кислоты, используемые для синтеза сигналобразующих молекул настоящего изобретения, обычно синтезируют из аминофенола, например, м-аминофенил борно-кислотные остатки и связь с меткой сигналобразующей части указанных сигналобразующих молекул или конъюгатов обычно создается с помощью образования иона диазония, силанизации, в результате использования таких агентов сочетания, как глутаровые диальдегиды, карбодиимиды, циангалогениды, сукцинимиды или любых других агентов сочетания, известных из общей химической литературы. Сигналобразующая метка присоединяется таким образом, что остатки борной кислоты остаются свободными и могут реагировать с цисдиолами гликозилированного гемоглобина и могут заранее "активизироваться", что делает их реакционноспособным в отношении аминных или других реакционноспособных фрагментов на дигидроксиборильных остатках, например, диметиламиазобензол изотиоцианата и диметиламинонафталин сульфонил хлорида. Сигналобразующие молекулы изобретения могут быть также дополнительно модифицированы с целью повышения их растворимости в воде.

Сигналобразующий дигидроксиборильный реагент, предназначенный для использования в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно присутствует в неиммобилизованной форме и включает остатки борной кислоты непосредственно или косвенно связанные с химическими структурами (метками) с образованием сигналов, которые могут использоваться в целях химического или физического количественного анализа. Сигналобразующая метка может содержать энзим(ы), предпочтительно те энзимы, которые не несут карбогидратных цисдиольных фрагментов или содержат небольшое количество частей с цисдиольными остатками. С другой стороны, сигналобразующая метка может быть частично или полностью представлена окрашенными или флуоресцирующими фрагментами. Большое число окрашенных, флуоресцирующих или пигментных соединений, подходящих для использования в качестве меток, известны из литературы и могут применяться для этой цели. Подходящими для этой цели примерами могут служить антрахиноны, азокрасители, такие азиновые красители, как оксазины и тиазины, триазины, такие природные пигменты, как порфирины, фикобилипротеины, включающие фикоэритрины и фикоцианины, хлорофилы, а также их аналоги и производные, каротеноиды, акринидины, ксантены, включая флуоресцеины и родамины, индигокрасители, тиоксантемы, кумарины, полиметины, включая ди- и три-арилметины, а также их производные, а также фталоцианины и метилл фталоцианины, необязательно связанные с помощью фрагментов, расположенных между сигналобразующей меткой и остатками борной кислоты, которые остаются свободными и могут реагировать с цисдиолами гликопротеинов, подлежащих анализу.

Аналогично большое число радиоактивных соединений может использоваться в качестве части сигналобразующей метки реагента изобретения, среди которых следует упомянуть соединения меченные иодом- 125. Такие меченные соединения могут быть получены введением метки I-125 в углеродное кольцо фенилборных кислот или конъюгацией аминофенил борной кислоты с реагентами, меченными I-125 например, с хорошо известным реагентом Болтон-Хантера. Обзор таких методов введения радиометки приведены Болтоном в Biochem J., 133; 529-539, 1973. При осуществлении способа настоящего воплощениях изобретения меченные I-125 конъюгаты могут смешиваться с нерадиоактивной борной кислотой или борониевой кислотами идентичной или различной структуры с достижением соответствующего уровня радиоактивности реагентов для анализа.

С другой стороны, остатки борной кислоты могут быть конъюгированы и природными или синтетическими соединениями, которые могут продуцировать хемилюминесцентный сигнал, который может анализироваться известным методом (Кормье М. Дж. с сотр. Хемилюминесценция и биолюминесценция. Пленум Пресс, Нью Йорк, 1973). Подходящие хемилюминесцентные соединения включают люциферин, оксалиновые эфиры, 1,2-диоксетаны, люминол или его производные, но не ограничиваются этими примерами. Для продуцирования хемилюминесцентного сигнала из используемых сигналобразующих молекул могут также использоваться пероксид водорода, такие энзимы, как люцифераза или другие химикалии.

Сильно анионные сигналобразующие конъюгаты не являются предпочтительными для использования в способе настоящего изобретения, поскольку они имеют тенденцию к связыванию с такими протеинами сыворотки, как албумин сыворотки человека (HSA), который может присутствовать в образце. Особенно подходящим примером использования вещества является конъюгат, полученный по реакции флуоресцеин изотиоцианата с аминофенил борной кислотой, что приводит к образованию конъюгата со свободными карбоксильными фрагментами. Другие подходящие конъюгаты включают аминофенилборную кислоту, конъюгированную с флуоресцеином, например, с помощью 1-этил-3-/3-диметиламинопропил/ - карбодиимидом (ЕДС), а также флуоресцеин изотиоцианат с блокированными карбоксильными группами или в тех случаях, когда фрагмент карбоновой кислоты удаляется конъюгированным с аминофенилборной кислотой. Может также использоваться родамин и конъюгированный, например, с помощью карбодиимида, с аминфенилборной кислотой, однако такой конъюгат достаточно плохо растворим в большинстве рассматриваемых растворов, предназначенные для анализа по методу изобретения. N-/резоруфин-4-карбонил/пи-перидин-4- карбоновая кислота -N-гидроксисукцинимидный эфир (далее в тексте сокращенно - ресос) представляет собой особенно предпочтительную сигналобразующую молекулу, которую авторы конъюгировали с аминофенилборной кислотой и который, как было показано, обладает отличной растворимостью, а также низкой степенью не специфического связывания с протеинами. Такая низкая степень связывания с протеином может быть результатом уменьшения числа анионных групп по сравнению с такими конъюгатами, как Г1TC-аминофенил борнокислотный конъюгат.

Остатки борной кислоты:

-B-/OH/₂,

часто называют дигидроксиборильными остатками в их электронейтральной форме и они образуют анионы в результате связывания гидроксильных ионов:

-B-(OH)₃- ,

и могут, как таковые, образовывать соли. Реагенты, используемые в способе изобретения, могут включать остатки с одной или более из таких форм борной кислоты в зависимости от значения pH и содержания электролита в композиции реагентов. Они находятся в анионной форме в том случае, когда борные кислоты связываются с цисдиольными остатками гликозилированных гемоглобинов. Однако анионная прочность остатков борной кислоты достаточно слаба, в результате чего не возникает проблем, связанных со связыванием таких протеинов, как HSA.

Предпочтительно, следует избегать использования высокомолекулярных сигналобразующих конъюгат с борными кислотами в способе настоящего изобретения из-за ограниченной возможности оценки гликозилированного фрагмента большинства гликозилированных гемоглобинов; значительная доля гликозилированного гемоглобина в крови гликозилированна по N -терминальному валину бета-цепочки, которая труднодоступна для водно-растворимых высокомолекулярных молекул, как это описано в ранее упомянутом патенте США N 4658022. В этом патенте описывается использование очень значительной денатурации с целью вовлечения гликозилированного остатка в реакции связывания антитела.

В соответствии с одним из воплощений способе изобретения общий гемоглобин может быть выделен из образца с помощью иммобилизованных связующих протеинов, специфичных в отношении гемоглобина, таких как антитела или гептоглобин, связанных с такими поверхностями, как фильтры, мембраны, шарики, гели, микротитрические полоски, трубки или пластины в результате гидрофобного взаимодействия или химического связывания либо непосредственно, или с помощью вторичных антител. Обычно но это не является предпочтительным, однако поскольку константы ассоциации между борной кислотой и цисдиольными остатками карбогидратов лежат в интервале 10³ - 10⁵ моль^-1 (Эванс с сотр. A aI. Biochem . 95: 383, 1979. Зиттл C.Advan.Enzym 12:493, 1951) и, следовательно, эффективная концентрация связующего протеина достаточно низка при иммобилизации, связывание борной кислоты с цисдиольными группами также уменьшается. В связи с этим для компенсации требуются высокие связующие способности и с технической точки зрения достижение такой цели затруднено. Это обстоятельство также ограничивает использование твердых фаз с низкой связующей поверхностью таких как поверхности полистирола. Однако связующая способность твердой фазы может быть повышена в результате использования гелей, микрошариков или других хорошо известных твердых фаз с большой площадью поверхности в расчете на единицу объема, однако, такие твердые фазы могут оказаться менее практичными в случае традиционного клинического использования. В том случае, когда иммобилизованные гемоглобин специфичные связующие протеины используют для выделения гемоглобина предпочтительно, чтобы в сигналобразующие молекулы вводили метки, отличные от щелочно-фосфатазной энзимной метки.

Согласно более предпочтительным воплощениям настоящего изобретения выделение гемоглобинов (и связанных с ними сигналобразующих молекул) достигается селективным осаждением общего гемоглобина из гомогенных растворов, например, путем использования соответствующих осадительных реагентов необязательно в совокупности с хроматографической, центрифугической или фильтрационной системой.

Таким образом, отделение гемоглобинов может осуществляться с помощью не иммобилизованных специфических гемоглобин связующих протеинов, таких, как специфические моноклональные или поликлональные антитела, гаптоглобины любых разновидностей, которые связывают человеческие гемоглобины или любые другие протеины, которые связывают гемоглобин и образуют осадок или как-либо иначе удаляют гемоглобин из раствора. Так, например, моноклональные антитела, реакционноспособные в отношении различных эпитопов или поликлональных антител, могут использоваться для этой цели с образованием осадка с гемоглобином. Осаждение также может быть осуществлено с помощью вторичных антител или с помощью гаптоглобинов в комбинации с антителами, реакционноспособными в отношении гаптоглобина. Предпочтительно использовать антитела без цисдиольных фрагментов или с дефицитом цисдиольных фрагментов или их иммунореакционноспособных фрагментов.

Однако, недостаток такого метода состоит в том, что поскольку константа диссоциации сигналобразующих молекул, содержащих борную кислоту и гликозилированных остатков гликозилированных гемоглобинов составляют величину в интервале 10³ - 10⁵ моль^-1 л, необходимо использовать достаточно высокие концентрации реагентов, в результате чего в течение испытания расходуется достаточно большое количество антител или гаптоглобина.

Согласно предпочтительным воплощениям настоящего изобретения специфическое осаждение гемоглобина из гомогенного раствора достигается в результате использования металлических катионов или органических растворителей. Преимущество такого приема состоит в том, что могут использоваться очень высокие концентрации гемоглобина, осадки могут быть легко отделены, например, центрифугированием или фильтрацией, а реагенты - дешевы и эффективны.

В одном из таких воплощений используется тот факт, что гемоглобин представляет собой протеин, хорошо, растворимый в воде, и авторы изобретения достигли специфического или близкого к нему осаждения гемоглобина из раствора в результате использования некоторых органических растворителей, например, таких спиртов, как этанол и/или бутанол, таких кетонов, как ацетон, простых эфиров, например, циклических эфиров таких, как диоксан и тетрагидрофуран, таких амидных растворителей, как диметилформамид или диэтилформамид, таких сульфоксидных растворителей, как диметилсульфоксид, таких углеводородных растворителей, как толуол и таких галогенированных растворителей, как хлороформ. При осаждении всего образца крови разбавленного до концентрации гемоглобина 6,5 мг/мл и HSA 1,5 мг/мл в результате добавления 50% бутанола (об/об.) в этаноле до конечной концентрации бутанола 9% (об.) осаждалось 94% гемоглобина и лишь 1% HSA. Такое осаждение осуществляли без потерь остатков борной кислоты связанных с цисдиольными фрагментами.

Специфическое осаждение гемоглобина может также достигаться с использованием металлических катионов, связывающих и агрегирующихся с протеином. Подходящие для этой цели катионы включают цинк, медь и менее предпочтительно никель, кобальт и кадмий. Осаждение гемоглобина с использованием хелатов меди или сульфата меди описано Ван Дамом с сотр. в Biotechnical Appl. 11(5), 492-502 (1989), однако не было предложено применение такого метода в анализе на гемоглобин. Важным преимуществом является тот факт, что любой гемоглобин, осажденный таким путем, может быть легко растворен повторно путем добавления солюбилизирующего комплексообразующего агента. Неожиданно было установлено, что при использовании ионов цинка может быть осуществлено практически специфическое осаждение гемоглобина из гемолизатов крови. Так, например, в результате использования концентрации ионов цинка 2,5-4 мМ в присутствии 6,5 мг гемоглобина и 1,5 мг HSA /мл может быть достигнуто специфическое или близкое к нему осаждение гемоглобина. Однако при концентрации ионов цинка выше 4 мМ происходит значительное соосаждение HSA. Этот факт иллюстрируется представленными ниже результатами (см. таблицу).

Однако следует тщательно поддерживать концентрацию ионов, чтобы не оказывать вредного влияния на используемые сигналобразующие производные борной кислоты. Если желательно, то осажденный гемоглобин может быть необязательно промыт или отфильтрован с целью удаления избытка катионов перед реакцией с сигналобразующим и конъюгатами борной кислоты. Такая реакционная последовательность особенно предпочтительна при использовании достаточно анионных сигналобразующих конъюгатов борной и кислоты, поскольку прямое связывание между избытком ионов цинка и анионными конъюгатами может в результате приводить к нежелательной интерференции. Помимо цинка, могут использоваться другие катионы металлов при условии, что они сами не осаждаются в буферном растворе, используемом для реализации осаждения, и обладают такой же специфической способностью осаждать гемоглобин, что и цинк.

В связи с возможностью участия ионов металлов в гидролизе и других реакциях с другими реагентами в используемом растворе, следует обращать особое внимание на то, что катионы металла оставались растворимыми и доступными в отношении осаждения гемоглобина.

Некоторые из сигналобразующих борнокислотных конъюгатов, описанных в настоящем описании, содержат группы, которые могут быть донорами электронных пар для катионов металлов и действовать, как комплектующие агенты. Такая способность образовывать комплексы лиганд-металл может быть использована для контролирования реакций, путем поддерживания иона металла в растворе, предотвращения образовывания комплексов между металлом и борно-кислотными сигналобразующими производными и обеспечения доступности и достаточно высокой концентрации ионов металлов с достижением желаемого осаждения гемоглобина в испытуемом растворе.

Поскольку следует учитывать как концентрацию лигандов, так и константы устойчивости различных металлических комплексов, соответствующие буферные соли могут использоваться для предотвращения образования нерастворимых металлических комплексов (на которые далее ссылаются, как на Me-комплексы).

Поэтому предпочтительными являются буферные соли, образующие слабые монодентатные Me-комплексы, и примером такого буфера может служить ацетат аммония в комбинации с цинком, образующий растворимые комплексы Zn(AC)₂ и Zn(NH₄)₂.

При добавлении к буферу более сильных комплексообразующих агентов, таких как мультидентатные хелатирующие лиганды все указанные реакции могут контролироваться в испытуемом растворе. Комплексообразующий агент добавляют в соответствующей молярной концентрации с получением необходимых молярных соотношений в различных комплексах и для уравновешивания других присадок с целью обеспечения оптимального протекания всех реакций. Кроме этого, комплексообразующий агент следует выбирать, имея в виду использование конкретного катиона металла с тем, чтобы избежать каких-либо нежелательных побочных эффектов, например, сильной закомплексованности иона металла.

Константа устойчивости хелатного Me-комплекса должна иметь достаточно высокое значение для того, чтобы конкурировать с другими возможными комплексообразующими агентами в испытуемом растворе, например, с сигнал борнокислотным конъюгатом, однако комплекс не должен быть столь прочным, чтобы понижалась или исключалась доступность катиона металла в качестве осаждающего агента.

Могут использоваться многие хелатирующие лиганды, включающие этилен-, пропилен- или бутилен-диамин, либо их аналоги, глицин, аспартат, нитрилоацетат, гистидин и поколинат. Некоторые другие природные или синтетические хелаторы, например, карбогидраты, органические кислоты с более, чем одной координирующей группой, аминокислоты, пептиды, фенольные вещества и топ. также могут использоваться для этой цели, однако, некоторые из них не являются предпочтительными из-за способности образовывать комплексы с борной кислотой, например, салицилаты, оксалаты, такие карбогидраты, как сорбит и тартрат вследствие того, что они конкурируют с гликозилированным гемоглобином в связывании с сигналборнокислотным конъюгатом.

Такие мультидентатные хелатирующие лиганды, как ЭДТА (этилен- диаминтетрауксусная кислота), СДТА (транс-1,2-диамоно-циклогексан -N,N,N", N"-тетрауксусная кислота, EGTA (этиленгликоль о-о"-бис/2-амино-этил/ -N,N,N",N"-тетрауксусная кислота), ДТРА (диэтилентриамин-пентауксусная кислота) и топ. также могут использоваться, однако в некоторых случаях они менее предпочтительны из-за их очень сильной комплексообразующей способности по отношению к ионам металлов, в результате чего сильно понижается степень осаждения гемоглобина. Примером предпочтительной комбинации может служить аммоний ацетатный буфер, содержащий ионы цинка и глицин.

В различных воплощениях настоящего изобретения могут быть предпочтительными различные комплексообразующие агенты. Обычно используются такие комплексующие агенты, как ЭДТА и ДТРП, однако их концентрация должна тщательно регулироваться при объединении с катионами металлов, используемыми для осаждения гемоглобина. Лимонная кислота и оксалиновая кислота менее предпочтительны из-за взаимодействия с остатками борной кислоты. Другими примерами веществ, находящих применение, могут служить гепарин и ионы фтора.

Осадки, полученные осаждением из гомогенных растворов, например, в результате использования органических растворителей или катионов металлов могут быть полностью или частично выделены с помощью центрифугирования или фильтрации, либо с помощью других способов, хорошо известных из литературы.

Фильтрующие мембраны или ТСХ-системы также могут использоваться для выделения гемоглобинов, необязательно в присутствии антител или их иммунореакционноспособных фрагментов или гаптоглобинов, иммобилизованных на них с целью связывания гемоглобина, как это имеет место в многослойном пленочном формате.

Одним из предпочтительных способов является выделение гемоглобина с помощью центрифугирования с последующим отделением осадка из надосадочной жидкости. Можно также использовать фильтрацию и эта операция может осуществляться либо вертикально относительно поверхности фильтра и через него, либо тангенциально или радиально внутри фильтра в рамках одномерного или двумерного способа разделения.

Могут также использоваться методы тонкослойной хроматографии, например, путем внесения образца в виде испытуемой полоски или геля в подходящую хроматографическую среду и применения реагентов и промывных растворов, например, непосредственно в месте внесения образца или путем элюирования.

Согласно дополнительным воплощениям гемоглобин может осаждаться из раствора непосредственно на или в фильтр или другую твердофазную хроматографическую среду и в этом случае осадок может отлагаться на или в твердой фазе после или одновременно с его образованием. Реагенты могут применяться на пористой твердофазной среде перед, одновременно или после стадии осаждения. Так, например, такие реагенты, как осаждающие агенты, сигналобразующие борнокислотные реагенты, гемолизирующие агенты, комплексообразующие агенты или другие реагенты, в любых предпочтительных комбинациях могут применяться в, или на твердофазной среде, предпочтительно в сухом виде. Такая реагентсодержащая твердофазная хроматографическая среда представляет собой еще один аспект настоящего изобретения. Такая твердофазная среда может быть необязательно промыта, либо раствор элюата может элюироваться через площадь осаждения.

Для гемолиза эритроцитов в общем образце крови и обеспечения хорошего химического контакта между гликозилированными гемоглобинами и сигналобразующими борнокислотными конъюгатами используется ряд реагентов и методов, хорошо известных из литературы, включая гипотонический гемолиз, применение таких детергентов, как неионный сложный эфир полиэтиленгликоля или производные сложного эфира полиоксиэтиленсорбита, например, "Тритон" и "Твин" хелаты, додецилсульфаты натрия, гуанидин, нагревания, воздействие ультразвука или любые комбинации таких методов.

Сигналобразующие конъюгаты борной кислоты могут контактировать или смешиваться с образцами гемолизата крови, выделенными из таких образцов, в среде буферного раствора для анализа до или одновременно со стадией гемолиза. Может использоваться ряд буферов для анализа, к которым относятся фосфатные буферы и другие буферные растворы, способные поддерживать значения pH реакционной смеси на подходящем значении pH. Предпочтительный интервал значений pH в анализе составляет 7,5-10,0, однако желаемое значение pH зависит от типа присадок, используемых буферных солей и значения pKa используемого производного борной кислоты, имеются свидетельства того, что буферы, содержащие амин, могут использоваться для усиления взаимодействия в системе дигидроксиборидцисдиол или для понижения кажущегося значения pKa бората. В связи с этим предпочтительными буферами являются серии, глицин, Гепес (4-/2-гидроксиэтил/-1-пиперазин-этансульфокислота), ацетат аммония, морфолин и таурин. Для дополнительного промотирования взаимодействия между дигидроксиборилом и цисдиольными остатками могут использоваться такие присадки, как двухвалентные катионы, детергенты и хаотрофные агенты с целью уменьшения степени отталкивания зарядов, солюибилизации целевых молекул, ограничения гидрофобного взаимодействия и увеличения доступности диолов в гликозилированном гемоглобине. Однако, следует избегать использования некоторых буферов, например. Трис и этаноламинов в связи с тем, что такие буферные соединения могут закомплексовывать борат и блокировать диолы от связывания. Некоторые комбинации буфер/присадка, например, фосфат-цинк, также нежелательны в связи с возможным образованием нерастворимых соединений подобных Zn(PO₄)₂.

Способ настоящего изобретения может осуществляться в температурном интервале 4-37^oC без значительных изменений в полученных результатах.

Способ настоящего изобретения включает оценку или количественное определение указанных сигналобразующих молекул (т. е. стадия считывания сигнала) и также, но необязательно, общее количество гемоглобина, присутствующего как в гликозилированной, так и в негликозилированной форме. В зависимости от того, какое из воплощений метода настоящего изобретения используется, сигнал может считываться с сигналобразующих молекул, связанных с гемоглобином или с остающихся сигналобразующих молекул, не связанных с гемоглобином. Наиболее практичной является оценка сигналобразующих молекул, связанных с гемоглобином, которые предварительно выделяют.

Оценка сигналобразующих молекул, связанных или отделенных от гемоглобина, достигается с помощью традиционного химического, обычно используемого для измерения энзимной активности, флуоресценции, радиоактивного облучения или по оптической плотности (поглощение), в зависимости от химической природы сигналобразующей метки. Цвет или флуоресценция на поверхности твердой фазы могут быть измерены с помощью рефлектометрии, которая, главным образом, используется в клинической практике.

На измерительной рейке или фильтрующем формате или других используемых на практике твердофазных форматах гемоглобина, либо флуоресцентные или окрашенные сигналу образующие конъюгаты могут быть оценены непосредственно на поверхности. С другой стороны, осажденные или иммобилизованные гемоглобин и/или сигналобразующие борнокислотные конъюгаты могут быть повторно растворены и измерены в растворе.

Аналогичным образом сигналобразующие борнокислотные конъюгаты, обладающие энзимной активностью, могут быть оценены в иммобилизованной или растворенной, либо повторнорастворенной форме с помощью энзимной технологии, хорошо известной из литературы. Это же касается радиоактивных борнокислотных конъюгатов, которые могут быть оценены с использованием хорошо известных радиометрических методов.

Концентрация выделенного гликозилированного и негликозилированного гемоглобина может быть определена по оптическому поглощению при соответствующих длинах волн в реакционной смеси до или после стадии отделения, либо может быть измерено содержание гемоглобина в выделенной фракции. Последнюю получают повторным растворением гемоглобина с последующим измерением оптического поглощения или путем рефлектометрии выделенных фракций, если необходимо, на твердой фазе. Если флуоресцентные сигналобразующие молекулы подвергают количественному определению в присутствии гемоглобина, то предпочтительно использовать длины волн возбуждения и эмиссии вне интервала длин волн поглощения гемоглобина. Аналогичным образом, если используют окрашенную сигналобразующую молекулу, то предпочтительными являются длины волн поглощения вне соответствующего интервала для гемоглобина, как это показано на фиг. 1, где приведен спектр поглощения гемоглобина и смеси RES 09-аминофенил борнокислотного конъюгата и гемоглобина. Однако, следует учитывать частичную интерференцию от гемоглобина и она должна быть скорректирована с помощью расчетов на базе измерений при более, чем одном значении длины волны.

Согласно одному из воплощений настоящего изобретения, гемоглобин и связанные сигналобразующие борнокислотные конъюгаты выделяют на микрошариках и/или фильтре, либо на другой твердой фазе с последующим рефлектометрическим количественным определением гемоглобина и сигналобразующих борнокислотных конъюгатов в результате измерения светопоглощения, или флуоресценции.

Согласно другим воплощениям настоящего изобретения используют образцы или аликвоты гемолизата с дефицитом некоторых, большинства или всех других протеинов, реакционноспособных в отношении борнокислотных остатков или их солей. Так, например, эритроциты могут быть промыты до гемолиза с целью удаления протеинов плазмы перед анализом гликозилированных гемоглобинов в образце. С другой стороны, гемолизат крови может быть обработан в ионообменном твердофазном сепараторе с целью удаления всех протеинов с изоэлектрическими точками ниже и/или выше, чем у гемоглобина. Такая очистка может необязательно составлять часть аппаратуры или набора для осуществления метода настоящего изобретения.

Согласно специальному воплощению настоящего изобретения, измеряют количество сигналобразующих молекул или конъюгата, который связан с гемоглобином в присутствии и отсутствии конкурирующего соединения. Конкурирующее соединение может представлять собой любую цисдиол содержащую молекулу, например, сорбит или маннит, или молекулы, содержащие борную кислоту, не обладающие сигналобразующей активностью.

Согласно другому специальному воплощению изобретения измеряют количество присутствующих сигналобразующих молекул либо в реакционной смеси и/или в выделенной фракции до и после отделения гемоглобина, что позволяет рассчитать долю сигналобразующих молекул, удаленных в результате связывания с гемоглобином.

Поскольку настоящее изобретение основывается на достаточно низкой прочности связывания константа ассоциации между цисдиольными фрагментами и остатками борной кислоты 10³ - 10⁵ моль^-1 л, непосредственное стехиометрическое связывание между гликозилированным гемоглобином и сигналобразующими борнокислотными конъюгатами не имеет смысла. Кроме этого, настоящее изобретение предусматривает способ, в котором все гликозильные фрагменты гемоглобина легко доступны в реакциях связывания, в результате чего достигаются более высокие соотношения связанный борнокислотный конъюгат: гемоглобин, чем доля гликозилированного гемоглобина по отношению к общему гемоглобину, обычно получаемая с помощью известных способов.

В небольшой степени свободные карбогидраты в крови могут конкурировать за остатки борной кислоты. Такие эффекты уменьшаются в результате использования избытка сигналобразующих борнокислотных конъюгатов. Удобно использовать двадцатикратный молярный избыток, однако, могут применяться более высокие или более низкие значения в зависимости от использования конкретного воплощения изобретения. Разумеется, будет иметь место фоновый сигнал, зависящий от эффективности используемых методов разделения. Если используется очень эффективная разделительная система, то следует применять большой избыток. Если невозможно использовать очень высокие концентрации реагентов, то концентрация гликозилированных гемоглобинов должна быть расчитана из измерений с использованием стандартов с известными концентрациями гликозилированных гемоглобинов и/или на основании точных значений констант ассоциации. Использование таких стандартов является общепринятым в клинической лабораторной медицине.

Настоящее изобретение также предусматривает композицию реагентов для осуществления описанного метода, причем указанный реагент включает молекулы, содержащие один или более борнокислотных остатков, способных свободно реагировать с гликозилированными остатками гликозилированных гемоглобинов, связанных с сигналобразующими метками, которые могут обладать энзимной активностью или быть окрашенными, флуоресцентными, хемилюминесцентными или радиоактивными, как это описано выше. Особенно предпочтительными являются композиции со слабо анионными сигналобразующими остатками.

Согласно еще одному аспекту изобретения предусматривается аналитический тест-набор для осуществления метода настоящего изобретения, включающий:

a) реагент, содержащий сигналобразующую молекулу, включающий конъюгат из одного или более дигидроксиборильных остатков или их солей, связанных с сигналобразующей меткой;

(b) средства для выделения гемоглобинов из образца, необязательно в комбинации с буферными солями или растворами.

Примеры.

Препараты.

Препаративный пример 1. 1. Конъюгат N-/резоруфин-4- карбонил/пиперидин-4-карбоновая кислоты-N-гидроксисукцинимидного сложного эфира (RESOS) с аминофенил борной кислотой.

Раствор A: 2 мг RESOS растворяли в 0,5 мл диметилсульфоксида.

Раствор B: Полусульфат м-аминофенил борной кислоты растворяли до концентрации 15 мг/л в 0,1 М буфере карбоната натрия, pH 8,0.

0,5 мл раствора A добавляли к 2 мл раствора В. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 12 ч. Очистку осуществляли методом HPIC. Структура конъюгата проиллюстрирована на фиг. 2.

Препаративный пример. 2. Конъюгат флуоресцеин изотиоцианита (FITC) с аминофенил борной кислотой.

Раствор A: 3,9 мг (FITC) растворяли в 1 мл диметилсульфоксида.

Раствор B: полусульфат м-аминофенилборной кислоты растворяли до концентрации 1,86 мг/л в 0,2 М карбонатного буфера, pH 9,5.

1 мл раствора А медленно добавляли к 10 мл раствора B при постоянном перемешивании. Смеси давали реагировать в течение, минимум 2 ч. при комнатной температуре и конъюгат FITC-аминофенил борная кислота очищали методом HPIC. Структура конъюгата проиллюстрирована на фиг. 3.

Препаративный пример 3. 3. Горнокислотный конъюгат, меченный иодом-125, A: 10 мг/мл аминофенилборной кислоты в 50 мл Na-фосфата, pH 7,5 реагировало с 14,2 мг/мл реагента Болтон-Хантара (BH) в среде DMCO. BH медленно добавляли к APBA до образования раствора в объемном соотношении 1 : 1. Этот раствор инкубировали в течение 1 ч. при комнатной температуре.

B: продукт реакции выделили на колонке с обратимой фазой с помощью градиента метанола в воде в присутствии 0,1% трифторуксусной кислоты (TPA).

C: Выделенный продукт реакции BH-APBA метили с помощью ¹²⁵2 -NaI с помощью хлораминового - T метода. 0,5 мл фракции BH-APBA добавляли к 0,1 мл 0,25 М Na -фосфата при pH 7,5 и pH установили равным 7,5. Помимо свежеприготовленного 0,3 мл хлорамин-T (10 мг/мл) 10 мкл ¹²⁵1 - Naal с активностью 100 мкС добавляли в 0,25 М Na-фосфат с pH 7,5 и смесь инкубировали в течение 1 мин.

D: Реакцию прекращали путем добавления 0,3 мл Na-бисульфата (24 мг/мл) в 0,25 М Na-фосфате с pH 7,5.

E. Меченый BH-APBA выделяли методом обратимофазной хроматографии с помощью метанольного градиента в воде в присутствии 0,1% TFA.

Препаративный пример 4. 4. Конъюгат борной кислоты с щелочной фосфатазой. 10 мг щелочной фосфатазы подвергали операции по уменьшении содержания молекул энзима, реакционного по отношению к борной кислоте путем пропускания через колонку с агарозой с иммобилизованными фенилборнокислотными остатками и смешивали с 30-кратным молярным избытком бис-/сульфосукцинимидил/ субстрата в карбонатном буфере с pH = 8.5 и оставляли реагировать на 120 мин при комнатной температуре, с последующим добавлением 100-кратного молярного избытка моноэтаноламина. Через 4 ч. энзимные конъюгаты очищали гель-хроматографией.

Примеры, демонстрирующие близкое к специфическому осаждение гемоглобина из полных гемолизатов крови.

Металлические катионы:

Раствор A: полный гемолизат крови разбавляли в 50 мм ацетата аммония с pH 8,0 до конечной концентрации 6,4 мг гемоглобина/мл.

Раствор B: Cu(SO₄) растворяли в воде до концентрации 10 мМ Cu₂₊.

Раствор C: ZnCl₂ растворяли в воде до концентрации 10 мМ Zn₂₊.

Препаративный пример 5. 40 мкл раствора B добавляли к 200 мкл раствора А. Полученную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. и осадок гемоглобина отделяли центрифугированием.

Препаративный пример 6. 40 мкл раствора C добавляли к 200 мкл раствора A. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин и осадок гемоглобина выделяли центрифугированием.

Примеры осуществления метода изобретения.

Пример 1. Во всех следующих примерах настоящего метода его сравнивали с классическим ионообменным HPIC методом согласно способу Дж.О.Дженсона с сотр: "Клиническая химия", 32/10, 1867-1872, 1988 (далее сокращенно "ионнообменный метод"). Образец крови гемолизировали и разбавляли в гемолизирующем аналитическом буфере, 100 мМ гепеса в присутствии 0,05% Тритона X-100, pH 9,0 до концентрации гемоглобина, примерно 8 мг гемоглобина/мл. Добавляли смесь 50% (об./об.) бутаназола в этаноле и описанный выше конъюгат FITC-аминофенил борная кислота до конечной концентрации бутанола 9% (об./об. ) и концентрации конъюгата 1,610^-4 М. Образовывался осадок, и его выделяли из надосадочного слоя с помощью центрифугирования. Полученный осадок повторно растворяли в 0,5 соляной кислоты в присутствии сульфоксида и концентрацию гемоглобина измеряли методом абсорбционной спектроскопии, а концентрацию конъюгата FITC-аминофенил борная кислота детектировали с помощью флуоресцентных измерений. Концентрацию гемоглобина и конъюгата FITC-аминофенил борная кислота расчитывали интерполяцией по калибровочным кривым, полученным в результате использования стандартных растворов с известными концентрациями гемоглобина и гликозилированного гемоглобина и расчитывали процентное отношение гликозилированный гемоглобин-общие гемоглобины.

Представленные ниже данные иллюстрируют результаты, полученные при реализации описанного метода.

% гликозилированного гемоглобина (ионнообменный метод) - молярное соотношение конъюгат/гемоглобин

4,8 - 0,284

7,8 - 0,344

11,7 - 0,431

Пример 2. Образец полной крови гемолизировали и разбавляли в гемолизирующем аналитическом буфере до концентрации гемоглобина примерно 8 мг гемоглобина/мл и добавляли конъюгат FITC-аминофенил борная кислота до конечной концентрации 210^-4 М. Этот образец инкубировали в течение 30 мин и добавляли 50% (об./об.) бутанола в этаноле до конечной концентрации бутанола 9% (об. /об. ). Образовавшийся осадок удаляли из надосадочного слоя центрифугированием. Этот осадок растворяли в 0,05 М соляной кислоты в присутствии 5% диметилсульфоксида и концентрации гемоглобина и конъюгата, измеряли, как описано в примере 5. Для подтверждения специфичности действия FITC-аминофенил борнокислотного конъюгата метод проводили по методике, описанной в примере 2, но с добавлением сорбита с концентрацией 0,1 М. Эта операция приводила к слабому неспецифическому связыванию конъюгата с гемоглобином и полученные результаты не демонстрировали различия между образцами с высоким и низким содержанием гликозилированного гемоглобина, как это проиллюстрировано ниже. Результаты, полученные без добавления сорбита:

% гликозилированного гемоглобина (ионнообменный метод) - молярное соотношение конъюгат/гемоглобин

4,4 - 0,259

7,1 - 0,340

11,4 - 0,473

Результаты, полученные при добавлении сорбита:

% гликозилированного гемоглобина (ионнообменный метод) - молярное соотношение конъюгат/гемоглобин

4,4 - 0,078

7,1 - 0,066

11,4 - 0,083

Пример 3. Этот метод осуществляли по методике, описанной в примере 1, но вместо отделения осадка центрифугированием, осажденный образец отделяли фильтрацией. Образец всей крови гемолизировали и разбавляли в гемолизирующем аналитическом буфере, 100 мМ Гепеса, 0,05% Тритона X-100, pH 9,0, до концентрации гемоглобина примерно 8 мг гемоглобина/ мл. Добавляли смесь 50% (об. /об.) бутанола в этаноле и конъюгат FITC-аминофенил борная кислота до конечной концентрации бутанола 9% (об./об.) и концентрации конъюгата FITC-аминофенил борная кислота 1,610^-4 М. Образовавшийся осадок выделяли фильтрацией с последующими количественными определениями гемоглобина и выделенного FITC-аминофенил борнокислотного конъюгата. Были получены следующие результаты:

гликозилированного гемоглобина (ионнообменный метод) - молярное соотношение конъюгат/гемоглобин

5,2 - 0,160

11,7 - 0,226

Пример 4. Образец полной крови гемолизировали и разбавляли в гемолизирующем аналитическом буфере, 100 мМ Гепеса в присутствии 0,05 /Тритона X-100, pH 9,0 до концентрации гемоглобина примерно 8 мг гемоглобина/мл. Смесь 50% (об. /об.) бутанола в этаноле и RESO S-аминофенил борнокислотный конъюгат, описанный выше, добавляли в систему до конечной концентрации бутанола 9% (об./об.) и концентрации конъюгата 1,610^-4 М. Образовавшийся осадок выделяли из надосадочного слоя центрифугированием. Осадок повторно растворяли в 0,05 М соляной кислоты в присутствии 5% диметилсульфоксида и концентрации гемоглобина и RESOS - аминофенил борнокислотного конъюгата измеряли по оптическому поглощению. Концентрации гемоглобина и RESOS - аминофенил борнокислотного конъюгата расчитывали интерполицией по калибровочным кривым, полученным в результате использования стандартных растворов с известными концентрациями гемоглобина и гликозилированного гемоглобина и расчитывали процентное количество гликозилированного гемоглобина. При таком осуществлении метода были получены следующие результаты:

% гликозилированного гемоглобина (ионнообменный метод) - молярное соотношение конъюгат/гемоглобин

4,9 - 0,212

11,2 - 0,294

Пример 5. Способ осуществления по методике, описанной в примере 4, но вместо отделения осадка центрифугированием осадок отделяли фильтрацией. Образец полной крови гемолизировали и разбавляли в гемолизирующем аналитическом буфере, 100 мМ Гепеса, 0,05% Тритона X-100, pH 9,0, до концентрации гемоглобина примерно 8 мг гемоглобина/мл. Добавляли смесь 50% (об./об.) бутанола в этаноле и RESOS - аминофенил борнокислотный конъюгат до конечной концентрации бутанола 9% (об./об.) и концентрации RESOS - аминофенил борнокислотного конъюгата 1,610^-4 М. Образовавшийся осадок выделяли фильтрацией с последующим количественным определением гемоглобина и выделенного конъюгата RESOS - аминофенил борной кислоты. Были получены следующие результаты:

% гликозилированного гемоглобина (ионнообменный метод) - молярное соотношение конъюгат/гемоглобин

4,9 - 0,195

13,0 - 0,367

Пример 6. Образец крови гемолизировали и разбавляли в гемолизирующем аналитическом буфере, 0,25 М ацетата аммония в присутствии 0,05% Тритона XХ-100, pH 9,0, до концентрации гемоглобина примерно 8 мг/л. К раствору гемолизированного гемоглобина добавляли RESOS - аминофенил борнокислотный конъюгат, 1,610^-4, в растворе 30 мМ ZnCl₂, а результате чего образовывался осадок. Такой осадок удаляли из надосадочного слоя центрифугированием с последующим повторным растворением осадка в 0,25 М аммоний ацетатного буфера, содержащего 30 мМ ЭДТА, pH 9.0. Концентрации конъюгата RESOS - аминофенил борной кислоты и гемоглобина оценивали методом абсорбционной спектроскопии. Были получены следующие результаты:

% гликозилированного гемоглобина (ионнообменный метод) - молярное соотношение конъюгат/гемоглобин

4,9 - 0,384

13,0 - 0,449

Пример 7. Метод осуществляли согласно методике, описанной в примере 6, но осажденный гемоглобин выделяли фильтрацией с последующим количественным определением гемоглобина и конъюгата RESOS - аминофенил борная кислота.

Пример 8. Кровь, гемолизованную в буфере Гепес, добавляли к меченному йодом -125 конъюгату борной кислоты (см. выше). Концентрация гемоглобина составляла 8 мг/мл. Через 30 мин инкубации добавляли 22 мкл системы этанол: бутанол /1 : 1 и осажденный гемоглобин выделяли центрифугированием. Осадок растворяли, в результате добавления системы HCl /DMCO/ вода и измеряли содержание и радиоактивность гемоглобина. Была обнаружена значимая корреляция между величиной радиоактивность/гемоглобин и содержанием гликозилированного гемоглобина.

Пример 9. Образец полной крови гемолизировали и разбавляли в гемолизирующем аналитическом буфере, 100 мМ Гепеса в присутствии 0,05% Тритона X-100, pH 9,0 до содержания гемоглобина примерно 8 мг/мл. RESOS -аминофенил борнокислотный конъюгат добавляли до конечной концентрации 210^-4 М, а CuSO₄ до конечной концентрации 2 мМ и в результате образовывался осадок. Осадок удаляли из надосадочного слоя центрифугированием. Осадок повторно растворяли в 0,05 М соляной кислоты в присутствии 5% диметилсульфоксида и концентрацию гемоглобина и RESOS - аминофенил борнокислотного конъюгата измеряли согласно описанному в примере 1. Были получены следующие результаты:

% гликозилированного гемоглобина (Ионнообменный метод) - молярное соотношение конъюгат/гемоглобин

4,6 - 0,524

12,0 - 0,617

Пример 10. Образец крови гемолизирован и разбавляли в гемолизирующем аналитическом буфере, 0,25 М ацетата аммония в присутствии 0,05% Тритона X-100 до концентрации гемоглобина примерно 8 мг/мл. Добавляли FITC - аминофенил борнокислотный конъюгат до концентрации 210^-4 М. Добавляли изопропанол до конечной концентрации 33% (об./об.) и происходило образование осадка. Осадок отделяли от надосадочного слоя центрифугированием. Такой осадок повторно растворяли в 0,05 М соляной кислоте, содержащей 5% диметилсульфоксида и концентрации гемоглобина и FITC - аминофенил борнокислотного конъюгата измеряли в соответствии с методикой примера 1. Были получены следующие результаты:

% гликозилированного гемоглобина (ионнообменный метод) - молярное соотношение конъюгат/гемоглобин

4,8 - 0,260

12,5 - 0,398

Пример 11. Метод осуществляли согласно описанному в примере 10, но осадок получали путем добавления тетрагидрофурана до конечного содержания 50% (об./об.). Были получены следующие результаты:

% гликолизированного гемоглобина (ионнообменный метод) - молярное соотношение конъюгат/гемоглобин

4,8 - 0,255

12,5 - 0,429

Пример 12. Метод осуществления в соответствии с описанным в примере 10, но осадок образовывали путем добавления N,N-диметилформамида до конечного содержания 15% (об./об.). Были получены следующие результаты:

% гликозилированного гемоглобина (ионнообменный метод) - молярное соотношение конъюгат/гемоглобин

4,8 - 0,198

12,5 - 0,211