способ получения иммуноглобулинового препарата

Формула изобретения

Способ получения иммуноглобулинового препарата, содержащего иммуноглобулины G, M и A, включающий коагуляцию и удаление белков неиммуноглобулиновой природы и липидов из исходного сырья, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют сыворотку крови крупного рогатого скота, а коагуляцию проводят путем ее обработки каприловой кислотой из расчета 2,0 - 9,0 мл кислоты на 100 мл сыворотки.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для профилактики и лечения инфекционных заболеваний кишечной группы человека и различных сельскохозяйственных и домашних животных, а также инфекций крупного рогатого скота, вызываемых другими различными группами бактерий и вирусов.

Известно, что основными средствами борьбы с инфекционными заболеваниями бактериальной природы являются антибиотики широкого спектра действия и подобные им препараты.

Однако лечение ими кишечных и других инфекций приводит к нарушению биоценоза кишечника, возникновению дисбактериоза, аллергизации организма и увеличению числа резистентных к ним патогенных штаммов микроорганизмов.

В связи с вышеизложенным важной практической задачей является разработка безвредных для макроорганизма, физиологичных и высокоэффективных препаратов для профилактики и лечения инфекционных заболеваний человека, особенно детей младшего возраста, и животных, прежде всего молодняка.

В последнее время в клинической практике наметилось новое направление: пассивная энтеральная иммунизация с помощью иммуноглобулиновых препаратов, содержащих специфические антитела к определенному виду возбудителя. Эти препараты не дают побочных эффектов и не угнетают нормальную микрофлору кишечника. Для производства этих препаратов необходимо иметь достаточно простой и высокоэффективный метод выделения иммуноглобулинов.

Известен способ получения гамма-глобулина путем его фракционирования по методу Кона спиртовым осаждением на холоду [1].

Спиртовой метод Кона имеет ряд недостатков: трудоемкость, длительность процедуры, необходимость наличия большого количества холодильного оборудования и значительное расходование спирта.

Описан способ получения комплексного иммуноглобулинового препарата из сыворотки крови человека для орального применения, содержащий три класса иммуноглобулинов. Способ предусматривает экстракцию осадка В (III фракция Кона), обработку экстракта хлороформом и декстрансульфатом с целью удаления липопротеидов, осаждение фракции иммуноглобулинов полиэтиленгликолем в концентрации 5% (авт.свид. СССР N 836683).

Однако данный метод отличается использованием значительного количества дорогостоящих химических реагентов, большой длительностью и сложностью технологического процесса, дороговизной и дефицитностью используемого сырья, а также неприемлемостью использования препаратов крови человека для нужд ветеринарии.

Цель изобретения - способ получения иммуноглобулинового препарата из сыворотки крови крупного рогатого скота, упрощение технологии производства и снижение себестоимости. 2 Указанная цель достигается тем, что в качестве сырья для получения иммуноглобулинового препарата используется сыворотка крови крупного рогатого скота, а осаждение балластных белков и липидов проводят каприловой кислотой.

Предварительно в сыворотке крови определяют титры антител к возбудителям кишечных заболеваний человека: энтеробактериям (сальмонеллы, эшерихии, шигеллы, клебсиеллы, протей и др.), синегнойной палочке, ротовирусу и т.д., а затем к микроорганизмам, вызывающим кишечные заболевания сельскохозяйственных и домашних животных. Параллельно с целью получения внутримышечных и внутривенных препаратов определяют активность сыворотки в отношении различных групп бактерий и вирусов, являющихся возбудителями инфекционных заболеваний у крупного рогатого скота. Титры антител определяют методами РТГА и РПГА.

С целью получения препарата в сыворотку крови крупного рогатого скота добавляют 1 М уксусную кислоту и доводят рН до 4,0-5,0. Затем медленно через шприц или делительную воронку при постоянном интенсивном перемешивании и температуре 18-30^oБС добавляют каприловую кислоту из расчета 2,0-9,0 мл на 100 мл сыворотки. После прекращения добавления реагента продолжают перемешивание в течение 1-2 ч. Далее проводят центрифугирование при 3000 об/мин в течение 50-60 мин, после чего осадок удаляют, а иммуноглобулины остаются в растворе. Затем доводят рН до 7,0 1 М едким натрием при интенсивном перемешивании, концентрируют и диализуют полученный препарат против физиологического раствора хлорида натрия.

Каприловая кислота, потребляемая людьми ежедневно вместе с пищей, входит в состав триглицеридов молочных жиров и составляет 4-8% (по данным разных авторов) от общей массы жирных кислот. Между тем она обладает антибактериальным действием, что в некоторых случаях немаловажно при обработке сыворотки крови. При доведении рН до нейтральной большая часть образующегося из оставшейся каприловой кислоты каприлата натрия выходит из раствора при диализе. Как стабилизатор белка каприлат натрия добавляется в препараты крови [2].

После определения титров антител к возбудителям инфекционных заболеваний в сыворотку крови крупного рогатого скота добавляют 1 М уксусную кислоту и доводят рН до 4,0-5,0. Затем медленно при постоянном интенсивном перемешивании и температуре 18-30^oС добавляют каприловую кислоту из расчета 2,0-9,0 мл на 100 мл сыворотки. После прекращения добавления реагента перемешивание продолжается в течение 1-2 ч. Далее проводят центрифугирование при 3000 об/мин в течение 50-60 мин, после чего осадок удаляют, а иммуноглобулины остаются в растворе. При обработке больших объемов сырья работа производится на сепараторной центрифуге. После фильтрования раствора доводят рН до 7,0 1 М едким натрием при интенсивном перемешивании. Затем проводят концентрирование и диализ на модуле с полыми волокнами против физиологического раствора хлорида натрия.

При концентрировании содержание белка доводится до 605 мг/мл. Определение проводят по биуретовому методу (ФС 42-344 ВС-90).

Чистота препарата более 99%. Контроль чистоты проводится в иммуноэлектрофорезе и электрофорезе на ацетатцеллюлозных пленках (РД 42-15-6-12-90).

Состав препарата: Ig G 80-90%, Ig A 0,5-2%, Ig M 5-15%.

Определение проводят методом радиальной иммунодиффузии по Манчини с кроличьими моноспецифическими антисыворотками к иммуноглобулинам крови крупного рогатого скота. Значительные различия в составе иммуноглобулинов и в ряде случаев невысокое содержание Ig M и Ig A в крови у отдельных представителей данных животных является физиологической нормой [3]. Соотношение иммуноглобулинов между собой по классам в исходном сырье и готовом препарате должно оставаться примерно на одном уровне. Выход препарата по иммуноглобулинам составляет 90%.

Титры антител к возбудителям инфекционных заболеваний человека и животных, определяемые методами РТГА и РПГА, зависят от специфической активности исходного сырья и в конечном препарате, в пересчете на концентрацию иммуноглобулинов остаются на прежнем уровне.

Предлагаемый способ получения высокоиммунохимически чистых иммуноглобулиновых препаратов прост, легко воспроизводим, технологичен, не требует дорогого специального оборудования и большого расхода химических реагентов, позволяет получить высокоэффективные пероральные препараты для профилактики и лечения кишечных инфекционных заболеваний человека и животных, а также внутримышечные и внутривенные препараты для лечения и профилактики инфекционных заболеваний крупного рогатого скота бактериальной и вирусной природы. Полученные данным способом препараты могут быть предложены для массового применения в медицине и ветеринарии.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Руководство по вакционному и сывороточному делу. Под ред. Бургасова П.Н. - М.: Медицина, 1978, с.315-321.

2. Русанов В.М., Скобелев Л.И. Фракционирование белков плазмы в производстве препаратов крови. - М.: Медицина, 1983.

3. Butler,J.E. Bovine immunoglobulines: an auqmented Revier. - Veterinary Immunology and Immunopathology, 4 (1983), 43-152.