способ длительного сохранения in vitro растений винограда

Формула изобретения

Способ длительного сохранения in vitro растений винограда, включающий микрочеренкование пробирочных растений с 8 - 10 междоузлиями на фрагменты длиной 10 - 12 мм с узлом и листом и высадку их на твердую питательную среду Мурасиге и Скуга, отличающийся тем, что в питательную среду добавляют тонкоразмолотые семена винограда в концентрации 1 - 2% от общего объема среды.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к сохранению генофонда вегетативно размножаемых растений. Изобретение может быть использовано в виноградарстве для селекционных целей, для создания коллекций и банка генов, регионального и международного обмена коллекционным материалом. Служит охране окружающей среды.

Известен способ, в котором замедление роста культур осуществляется снижением температуры культивирования. (Хранение коллекции винограда in vitro при пониженной температуре. Н. П. Дорошенко и др. Виноград и вино России, 1994, N 3, с. 24). Недостатком способа является то, что для его осуществления необходимы холодильные камеры и большие затраты электроэнергии на их круглосуточную работу.

Другой способ заключается в использовании гормональных или осмотических ингибиторов (Сохранение in vitro генофонда (Г.С. Муранцев и др. Основы сельскохозяйственной биотехнологии - М. : 1990, с. 188). Недостатком способа является удорожание технологии из-за высокой их стоимости.

Известен способ подавления роста растений за счет изменения состава питательной среды. Недостатком этого способа является то, что добиться ограничения роста, удаляя или сокращая количество необходимых питательных веществ, чрезвычайно трудно. Этот подход нуждается в дополнительном исследовании для каждого перспективного сорта.

Известен способ, в котором для поддержания исходных культур используют постоянное выращивание растений при более или менее оптимальных условиях (Л. А. Уизере Криосохранение и хранение генофонда. Биотехнология растений: культура клеток. М.: 1989, с. 204) - прототип. Для поддержания культуры тканей обычно требуются регулярные пересадки на свежую питательную среду через 1 - 1,5 мес, что оказывается довольно трудоемким процессом при наличии нескольких десятков или сотен сортов в коллекции.

Поэтому как в практическом, так и в научном отношении необходимы альтернативные методы хранения, требующие меньше времени и финансовых затрат.

Медленный рост в течение всего периода выращивания при оптимальных условиях культивирования характерен для небольшого числа культур. Недостатком данного способа является то, что для большинства культур, и в том числе для винограда, необходимы факторы, ограничивающие рост. А так же то, что пересадки растений на новую питательную среду производятся через 1,5 - 2 мес, что требует значительных трудовых и материальных затрат.

Изобретение предназначено для повышения эффективности длительного хранения винограда без дополнительных затрат.

В предложенном способе длительного хранения винограда in vitro, включающем микрочеренкование пробирочных растений с 1 - 10 междоузлиями на фрагменты длиной 10 - 12 мм с узлом и листом и высадку их на твердую питательную среду Мурасиге и Скуга, в питательную среду добавляют тонкоразмолотые семена винограда в концентрации 1,0 - 2,0% от объема среды.

Новым в предложенном способе является то, что ограничения роста пробирочных растений достигают за счет питательной среды, в состав которой вводят семена винограда в таком количестве, что они являются естественными ингибиторами роста.

Существенным является то, что семена винограда добавляют в питательную среду не в виде экстракта, как рекомендуют добавлять ростовые вещества, а в виде тонкоразмолотого порошка.

При проведении поиска по патентной и научно-технической литературе не было обнаружено подобного способа. Из научно-технической литературы (Козуб Г. И. Технология вина. - Виноделие и виноградарство СССР, 1985, с. 13) известно, что виноградные семена используют при производстве масла, кормовой муки, удобрений, естественного парника. В предложенном способе семена используются как ингибиторы роста, потому что в них находятся вещества с ценными биологическими свойствами: абсцизовая и хлорогеновая кислоты, общие фенолы, рутин, свободные ауксины и цитохинины. Причем суммарное количество ауксинов, цитохининов, хлорогеновой кислоты и рутина составляет 37 - 54 мкг/100 воздушно-сухой массы, а абсцизовой кислоты и фенолов - 5938 мкг/1 г (Зозникова Е. и др. Определение ряд ряда ретардантов в экстракте семян винограда. - Физиология растений. София, 1989, т. 15, N 3, с. 27 - 31. Абсцизовая кислота в большинстве случаев тормозит рост растений. Причем этот фитогормон может выступать антогонистом НУК, цитохинина и гибберелинов.

Использование семян винограда в виде тонкоразмолотого порошка позволяет адсорбировать токсические вещества, выделяемые растениями при их микрочеренковании в питательную среду, и заменить таким образом активированный уголь. То есть, налицо неоднозначность предлагаемого приема; адсорбирование токсических веществ, выделяемых пробирочными растениями в питательную среду при их микрочеренковании, с целью увеличения регенерационной способности выделенных эксплантов, и введение в состав питательной среды большого количества абсцизовой кислоты, являющейся ингибитором роста.

Способ осуществляется следующим образом.

Отбирают клонально-размноженные из меристематических верхушек пробирочные растения винограда, которые должны иметь 8 - 10 глазков.

Приготовление питательной среды Мурасиге и Скуга осуществляют по общепринятой методике. Применяют следующий порядок приготовления питательной среды. В 1 л бидистиллированной воды растворяют макроэлементы, витамины и другие составные части среды.

Навеску предварительно промытого и высушенного агара переносят в колбу, заливают половинным количеством (от объема среды) бидистиллированной воды и нагревают на плите до 80- 100^oC. Семена винограда тщательно промытые и высушенные перемалывают на лабораторной мельнице до мелкой фракции около 5 мин. Добавляют их в раствор макро- и микроэлементов, сахара, витаминов и других составных частей среды. Молотые семена добавляют в концентрации 1,0%. После растворения и некоторого охлаждения агара к нему добавляют приготовленный раствор. Температура агара и добавленность раствора одинаковая и составляют 80^oC.

Среду фильтруют через два слоя марли и доводят до нужного объема бидистилянтом. Готовую среду разливают по пробиркам, которые закрывают предварительно простерелизованными в автоклаве ватными пробками, штатив с пробирками закрывают целофаном, их обвязывают шпагатом и затем среду стерилизуют в автоклаве ГК-1000.

Микрочеренкование осуществляют в операционной комнате в ламинарном боксе "Роботрон". Побеги, имеющие 8 - 10 глазков, при помощи пинцета извлекают из пробирки, помещают на стерильную чашку Петри, разрезают на микрочеренки, имеющие узел с листом и почкой. Длина микрочеренка 10 - 12 мм, 2 мм над почкой, остальное под почкой. Полученные микрочеренки высаживают в пробирки с приготовленной твердой средой так, чтобы нижняя часть до почки была погружена в агар.

Культивирование осуществляют в культуральной комнате при освещенности 2,0 - 3,0 тыс. люксов, фотопериоде 16 ч, температуре 25, 27^o 2^oC, влажности воздуха 70 - 75%.

Наблюдения за ростом осуществляют через 15 дн.

Добавление размолотых семян винограда в питательную среду производят в концентрации 1 - 2% от ее объема, что ингибирует развитие корневой системы. При этом уменьшается в 1,7 раза образование корней; длина как главного, так и придаточных корней; и в конечном итоге, общая масса корней уменьшается в 3,6 раза (табл. 1). Это объясняется высоким содержанием абсцизовой кислоты и фенолов в составе семян виногруда.

Это в свою очередь ингибирует рост побегов, образование листьев и новых точек роста (узлов). Торможение роста побегов начинается уже при концентрации семян винограда в составе питательной среды 0,5%, но наибольшее замедление роста отмечено при концентрации 1,0 и особенно 2%. При концентрации размолотых семян винограда 10,0% развитие пробирочных растений отсутствовало (табл. 2).

Таким образом, добавление в питательную среду размолотых семян винограда в концентрации 1,0 - 2,0% от объема среды создает в ней такой уровень естественных ингибиторов, при котором уменьшается образование и рост корней, что в свою очередь тормозит рост побегов в высоту, развитие листовой поверхности, увеличение общей массы побегов. В результате этого уменьшается число узлов (листьев, в пазухе которых находится почка), которые дают начало новым растениям in vitro после их микрочеренкования, т.е. уменьшается потенциальное микроразмножение и, как следствие, увеличиваются в 3 - 4 раза промежутки времени между пересадками растений на свежую питательную среду (табл. 3).

Отмеченное торможение образования корней и их длины, уменьшение скорости роста побегов, ингибирование их роста в длину и закладки новых узлов наблюдалось в течение всего периода культивирования с 14 до 75 дн (табл. 4).

Таким образом, предложенная совокупность признаков способствует замедлению роста и развития пробирочных растений в 3 - 4 раза, благодаря чему увеличивают промежутки времени между пересадками растений на свежую питательную среду, которые можно проводить не через 1,5 - 2 мес. (прототип), а через 4 - 6 мес. Это повышает экономическую эффективность длительного хранения винограда in vitro, так как уменьшается трудоемкость процесса и замедление роста пробирочных растений достигается без дополнительных затрат.