способ получения (6s)-изомеров производных фолиевой кислоты

Формула изобретения

1. Способ получения (6S)-изомеров производных фолиевой кислоты общей формулы I



где X представляет собой CH₃ или CHO;

R₁ и R₂ являются H, NH⁺₄, щелочными и щелочноземельными металлами, причем R₁ и R₂ могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга,

путем разделения смеси (6R, S) диастереоизомеров общей формулы I, включающий пропускание через колонку водного раствора альбумина, промывку колонки водным раствором фосфатного буфера, загрузку смеси (6R, S) диастереоизомеров формулы I и элюирование (6S) изомеров водным раствором фосфатного буфера, отличающийся тем, что концентрация альбумина в растворе составляет 0,1 - 10 мас.%, промывку колонки осуществляют в три этапа - буферным раствором с рН 5, затем буферным раствором с рН 7 и, наконец, буферным раствором с рН 5, концентрация раствора смеси (6R, S) диастереоизомеров 0,1 - 10 мас.%, рН буферного раствора для элюирования 4,8 - 5,8.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные буферные растворы являются фосфатными буферами с концентрацией между 0,05 и 0,15М.

3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что указанную колонку загружают силикагелем с размером гранул 25 - 60 мкм.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что размер гранул силикагеля составляет 35 - 45 мкм.

5. Способ по пп. 1 - 4, отличающийся тем, что концентрация указанного альбумина в его водном растворе составляет примерно 1 мас.%, а концентрация указанной смеси диастереоизомеров составляет примерно 5 мас.%.

6. Способ по пп.1 - 5, отличающийся тем, что указанный альбумин выбирают из группы, включающей свиной, бычий, овечий, кроличий, куриный и яичный альбумин.

7. Способ по пп.1 - 6, отличающийся тем, что указанный водный раствор альбумина буферируют при рН 5.

8. Способ по пп.1 - 6, отличающийся тем, что указанный водный раствор указанной смеси диастереоизомеров буферируют при рН 5.3

Описание изобретения к патенту

Изобретение касается способа промышленного получения (6S) - производных фолиевой кислоты путем хроматографического разделения смеси диастереоизомеров на колонке, в частности способа промышленного получения 5-(метил)-(6S)-тетрагидрофолиевой кислоты и 5-(формил)-(6S)-тетрагидрофолиевой кислоты, обозначенных "MTHF" и "FTHF". MTHF и FTHF являются физиологическими молекулами, которые вместе с менее стабильными 6,10-метилентетрагидрофолиевой кислотой и тетрагидрофолиевой кислотой образуют in vivo активные формы фолиевой кислоты, обычно называемые софакторами фолиевой кислоты.

С терапевтической точки зрения и MTHF, и FTHF находят применение во всех случаях фолат-недостаточности, как правило, для защиты печени, реже в противоопухолевой терапии.

MTHF, FTHF и обычно используемые их терапевтически пригодные производные представлены следующей формулой (1):



где

X = CH₃ или CHO;

а R₁ и R₂ являются H, NH⁺₄, щелочными или щелочноземельными металлами, причем R₁ и R₂ могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга.

Соединения формулы (1) имеют два асимметрических атома углеводорода и, следовательно, могут существовать в четырех диастереоизомерных формах.

Хорошо известно, что обычно при существовании стереоизомерных фармацевтических форм активной является только одна из них, остальные неактивны или даже вредны. В данном случае хорошо известно, что активны формы (6S).

Проведены некоторые исследования, касающиеся промышленного получения и/или выделения двух диастереоизомеров и прямого синтеза (6S)-формы.

Стереоспецифический анализ (6S)-формы (и MTHF, и FTHF) так же, как и разделение двух (6RS)-диастереоизомеров, является трудным делом, в результате которого получают структурно неустойчивые конечные продукты.

Синтез стереоизомерной смеси MTHF и FTHF описан в патентах GB-A-1 572138 и CH-A-496012 соответственно.

Для выделения (6S)-диастереоизомеров из смесей, полученных таким образом, возможно перевести смесь стереоизомеров в соответствующие 5-метоксикарбонильные производные или в другие производные с хиральным центром: используя таким образом различные растворимости в соответствующих растворителях, возможно разделить два указанных диастереоизомера, (6R) и (6S) [2]. Указанный способ сложен, а выход при этом предельно низок.

Другие способы разделения основаны на многократных кристаллизациях как (6R, S) - смеси [1], так и промежуточного продукта, но всегда дают низкие выходы.

Последнее разделение смесей стереоизомеров MTHF и FTHF получено в [3] фракционированной кристаллизацией и гидролизом или восстановлением (по выбору) 5,10-метилен-(6RS)-тетрагидрофолиевого промежуточного продукта, с которым очень трудно оперировать и выделять из вредного и токсичного растворителя, такого как муравьиная кислота.

Способ выделения (6S)-формы раскрыт в [1], в котором раствор соли кальция или магния указанной смеси стереоизомеров обрабатывают амином, осаждая в виде оксалата соль указанного катиона и получая требуемый продукт путем фракционированной кристаллизации и обратного превращения в соль кальция или магния.

Получаемые выходы достаточно низки, и способ включает несколько стадий получения солей и кристаллизации.

В другом способе разделения рацемическую смесь в виде соли кальция (EP 367902) добавляют к определенному количеству органических и неорганических солей, в частности йодиду натрия, получая таким образом продукт с высокой степенью чистоты, но опять же с достаточно низким выходом, что несомненно бессмысленно с промышленной точки зрения.

Известен еще один способ разделения изомеров FTHF [4], в соответствии с которым используют силикагель, пропитанный альбумином бычьей сыворотки (BSA). В качестве элюанта используют фосфатный буфер с диапазоном величин pH от 6,4 до 8,4, предпочтительно 7,4.

Элюат, полученный в соответствии со способом Choi и др., содержит очень небольшое количество изомера (6S), пригодное исключительно для аналитических целей.

Применение способа Choi и др. в промышленных условиях дало бы в результате достаточно большое время задержки раствора в колонке из-за слабого разделения, что не подходит для промышленного производства, т.к. для получения подходящего разделения необходимо было бы использовать колонку чрезвычайно долго или действовать растворителем на одну колонку несколько раз, что увеличивает возможность разделения смеси и очень сильно повышает расход реагентов.

Было найдено, что в соответствии с изобретением, следуя методике Choi и др. , но используя в качестве элюирования смеси (6R,S) буферный раствор с очень узким диапазоном величин pH (между 5,0 и 5,5), получают выделение (6S) - изомера с промышленным выходом дешевле и простым способом.

Используя две промышленные колонны, заполненные силикагелем, пропитанным альбумином, и разделяя (6R,S) - смесь в соответствии со способом Choi и др. и способом по изобретению, получают выходы (6S)-изомера ниже 5% и не ниже 20% соответственно.

Кроме описанных выше способов выделения (6S)-изомеров из смеси (6S,R) были сделаны попытки прямого синтеза (6S)-изомеров.

В соответствии с патентом EP-A-356984 синтез (6S)-изомера проводили способом, основанным на стереоспецифическом гидрировании (5 - 6)-двойной связи 7,8-дигидрофолиевой кислоты. Если указанное гидрирование проводят дигидрофолиатной редуктазой в присутствии NADP, достигают хорошей конверсии однако указанный способ чрезвычайно сложен и не всегда пригоден с промышленной точки зрения.

Были опробованы другие типы стереоспецифического гидрирования с использованием подходящих катализаторов, но результаты всегда были плохими (Tetrahedron 42, 117, 1986).

Наконец, сегодня не существует дешевого способа, подходящего в промышленном смысле для получения (6S)-изомеров MTHF и FTHF. Что касается практического терапевтического применения, (6S)-MTHF и (6S)-FTHF не используют как таковые, но используют как соли, обычно соли кальция. Такое превращение проводят хорошо известными способами, например, в соответствии со способами, раскрытыми в патенте США US-A-2 688018 и в работе Weast "Handlook of Chemistry and Physics (57-е издание: с.B-100).

Из смеси (6R,S)-MTHF или (6R,S)-FTHF выделяют соответствующий (6S)-изомер способом, в соответствии с которым в хроматографическую колонку загружают водный раствор альбумина, затем промывают первым буферным раствором, загружают водный раствор смеси диастереоизомеров производного формулы (1), затем элюируют вторым буферным раствором, получая (6S)-диастереоизомер в качестве первого элюата для FTHF и второго элюата для MTHF способ отличается тем, что концентрация раствора альбумина составляет от 0,1 до 10 мас.%, раствор производных имеет концентрацию от 0,1 до 10 мас.%, а pH указанных буферных растворов составляет 4,8 - 5,8.

Предпочтительно сначала промывать колонку буферным раствором с pH 7, а затем с pH 5 до загрузки смеси диастереоизомеров производного формулы (1).

Еще предпочтительно, чтобы pH водных растворов альбумина и смеси диастереоизомеров поддерживался в диапазоне 4,8 - 5,8. Кроме того, предпочтительно, чтобы силикагель имел гранулометрию (размер гранул) между 25 и 60 мкм, более предпочтительно 35 - 45 мкм.

Преимущественными буферными растворами являются фосфатные буферы с концентрацией 0,05 - 0,15 М, концентрация указанного альбумина в его водном растворе составляет величину около 1 мас.%, а концентрация смеси диастереоизомеров в растворе составляет величину около 5 мас.%, при этом альбумин выбирает из группы, включающей свиной, бычий, овечий, кроличий, куриный и яичный альбумин.

Очевидно, что буферные растворы, используемые в разных фазах предлагаемого способа, могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга. В качестве буферных растворов можно использовать растворы фталатов, фосфатов, ацетатов и т.д., предпочтительно фосфатов.

В соответствии с предпочтительным способом в качестве элюента для хроматографической колонки, предварительно загруженной раствором кальциевой соли (6R,S)-метил-тетрагидрофолиевой кислоты, используют 0,05 М фосфатный буфер (0,15 М фосфатный буфер в случае кальциевой соли (6R,S)-формил-тетрагидрофолиевой кислоты).

Наконец, в соответствии с изобретением возможно довести производительность способа деления до промышленного уровня, достигая предельно короткого времени элюирования.

Изобретение описывается подробно со ссылкой на преимущественные варианты. Однако оно ни в коей мере не ограничено этими отдельными вариантами.

Выходы, представленные в следующих примерах, выражены в виде весовых значений, которым соответствует двойной оптический выход.

Пример 1. В промышленную колонну диаметром 0,90 м и высотой 6,0 м загружают силикагель (диаметр частиц 35/45 мкм, суспендированный в 0,15 М буферном водном растворе при pH 5, содержащем меркаптоэтанол (0,1мас.%), заполняя колонну почти полностью (до высоты 5,5 м, что соответствует примерно 3600 г силикагеля).

Получение хирального субстрата проводят следующим образом, в колонну загружают раствор яичной сыворотки альбумина (1% в 0,15 М фосфатном буфере, pH 5,0), вслед за абсорбцией в УФ при 280 нм на элюированной жидкости. Количество альбумина, абсорбированного на силикагель, равно 200/400 кг. Элюирование проводят, используя 10000 л 0,15 М фосфатного буфера с pH 5,0, затем 10000 л 0,15 М фосфатного буфера с pH 7 и, наконец, 10000 л 0,15 М фосфатного буфера с pH 5,0. Затем добавляют 5%-ный раствор кальциевой соли 5-формил-(6R,S)-тетрагидрофолиевой кислоты, эквивалентный 5 кг (время истечения при этом составляет 200/400 л/ч), элюируя его вместе с 0,15 М фосфатным буфером с pH 5,0. Собирают фракции по 500 л.

(6S)-фракции элюируют раньше (6R)-фракций. Элюирование фракций можно по ходу контролировать при помощи поляриметра, снабженного проточной ячейкой, и затем точно дозировать при помощи жидкостной хроматографии при высоком давлении (HPLC). Достаточно чистые фракции выделяют для требуемых целей. Чистые фракции собирают и переводят в соль известными способами.

Выход: 1,9 (28%) (6S)-фолината кальция, Титр: HPLC>98%. Оптическая чистота >97%.

Пример 2. В данном примере воспроизводят на промышленном уровне методику Choi и др. Используя такой же тип колонны и такой же способ подготовки стационарной фазы, способ проводят как в примере 1. Элюирование осуществляют, используя 10000 л 0,15 М фосфатного буфера с pH 7. В колонну добавляют 5%-ный раствор кальциевой соли (6R,S)-фолиевой кислоты, эквивалентный примерно 5 кг, при скорости истечения 200/400 л/ч. Элюирование проводят фосфатным буфером с pH 7. Собирают фракции по 500 л.

Разделение неудовлетворительное; цикл очистки повторяют четыре раза, пытаясь получить частичное разделение. Текст отбрасывают вследствие недостаточного разделения.

Пример 3. Применяют такой же как в примере 1 тип колонны и такой же способ подготовки стационарной фазы, но используют в данном примере свиной сывороточный альбумин (PSA).

Выход: 1,5 кг (30%) (6S)-фолината кальция. HPLC титр: >98%. Оптическая чистота: >97%.

Пример 4. Применяют такой же как в примере 1 тип колонны, но для подготовки стационарной фазы и для последующих стадий абсорбции и элюирования используют дегазированную воду.

Для элюирования используют 10000 л 0,15 М фосфатного буфера с pH 5,2, с ним добавляют 5%-ный раствор (6S)-метил-тетрагидрофолиевой кислоты, эквивалентный 10 кг, при скорости истечения 200/400 л/ч.; снова проводят элюирование 0,05 М фосфатным буфером с pH 5,2, собирая фракции по 500 л.

(6S)-Фракции элюируют после (6R)-фракций. Достаточно чистые фракции выделяют для требуемых целей, собирают и обрабатывают известными способами.

Выход: 3,9 кг (39%) кальциевой соли (6S)-метилтетрагидрофолиевой кислоты. HPLC титр: >97%. Оптическая чистота: >97%.