способ исследования активации и агрегации тромбоцитов

Формула изобретения

1. Способ исследования активации и агрегации тромбоцитов, включающий получение обогащенной тромбоцитами плазмы из крови, разбавление ее изоосмотической средой, помещение полученной плазмы в кюветное отделение фотометра, снабженного перемешивающим устройством, и измерение амплитудно-частотной характеристики светорассеяния в определенном угле после действия агонистов (АДФ, тромбин), отличающийся тем, что разбавление производится в 20 - 100 раз физиологической солевой средой с малым коэффициентом преломления и измеряется интенсивность светорассеяния в углах от 0 до 20^o или от 180 до 160^o.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для регистрации активационных стадий и агрегации используются одновременное измерение интенсивности светорассеяния в двух углах.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что для прохождения агрегации в солевую среду добавляется двухзарядный катион (например CaCl₂).

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способам исследования функциональной активности тромбоцитов, конкретно к регистрации активации тромбоцитов: сферизации клеток и образование псевдоподий, а также и к регистрации агрегации клеток, и может быть использовано клинико-диагностическими лабораториями медицинских учреждений для выполнении диагностики предтромбоза и тромботических состояний, фармацевтическими предприятиями для тестирования действия фарм-препаратов и научными лабораториями для исследования молекулярных механизмов функционирования тромбоцитов и принципов организации сигнальных систем.

Анализ активации и агрегации тромбоцитов относится к важнейшим задачам гематологии, поскольку диагностика тромбозов широко распространена в клинической практике и играет важную роль в оценке патогенеза многих заболеваний. Летальность от ишемической болезни сердца и тромбозов сосудов головного мозга составляет в развитых странах 40-50% от общей летальности взрослого населения.

Наиболее распространенным способом оценки функциональной активности тромбоцитов является регистрация агрегации тромбоцитов по изменению пропускания - метод Борна (G.V.Born, V.J.Cross The aggregation of platelet. // J. Physiol. 1963, V. 16,P178-195). В этом методе при регистрации используется обогащенная плазма тромбоцитов с низким содержанием ионов кальция в среде.

Существенным недостатком этого метода является трудность регистрации активации тромбоцитов по пропусканию в плазме, поскольку доля активационного сигнала составляет несколько процентов от общего сигнала (Born G.V.R. Odservations on the change in shape of blood platelets brought abort by adenosine diphosphate. //J.Physiol. -1970-V.209.P487-511) и невозможностью проводить оценку при физиологической концентрации ионов кальция в среде (около 1 mM). Микроскопический метод оценки форм тромбоцитов, обладая простотой и доступностью в клинической практике (Шитикова А.С. Изменение формы тромбоцитов как показатель их внутрисосудистой активации. В сб. "Клинико-лабораторная диагностика предтромбоза и тромботических состояний", С-Петербург: 1991, с. 38-52), является трудоемкими в исполнении, не реализуется в аппаратурном исполнении и не позволяет проводить кинетических исследований.

Более широкими возможностями в регистрации активации и агрегации обладают рео-оптические методы, связанные или с изменением величины светопропускания при изменении скорости перемешивания (Latimer P.,Born G.V.R.,Michal F. Application of light-scatteting theory to the optical effects associated wint the morphology of blood platelets. //Arch.Biochem.Biophys. -1977-V.180. P151-159. ; Holme S.,Murphy S. Quantative measurement of platelet shape by light transmission studies application to storage of platelets for transfusion. //J.Lab.Clin.Med.-1978-V.92(1).P53-64.) или анализом флюктуаций интенсивности прошедшего света (Габбасов.В.А, Попов.Е.Г, Гаврилов.И.Ю, Позин.Е.Я, Маркосян.Р.А. Новый методический подход к исследованию агрегации тромбоцитов in vitro. // Бюл. экспер., биол., 1989, N10, с. 437-440). Последний метод позволил авторам разработать новый способ определения индивидуальной чувствительности к нифедипину у больных сердечно-сосудистых заболеваний [2]. Возможности этих методов ограничены тем, что полученные результаты сильно зависят от гидродинамических характеристик измерительного прибора. Позволяя получить хорошее разрешение активационного и агрегационного процессов (в отличие от метода Борна), эти методы не позволяют различать активационные стадии (сферизация и образование псевдоподий). Другим недостатком этих методов является то, что все они реализованы в условиях плазмы с низким нефизиологическим значением концентрации ионов кальция в среде.

Широкое распространение получили проточные цитометрические анализаторы. Применение анализаторов в исследовании активации и агрегации (Barradas MA; O"Donoghue S; Milkhailidis DP Measurement of platelet volime using a channelyzer: assessment of the effect of agonists and antagonists. // In Vivo. -1992- V. 6(6). P. 629-34), (Pradalier A; Abuaf N; Launay JM; Vincent D Platelet size and volume distribution measured by automated platelet analyzer. // Cephalalgia. -1992-V.12(5). P 321-2.) дало удовлетворительные результаты, однако анализаторы не позволяют производить непрерывную регистрацию.

Использование светорассеивающих характеристик тромбоцитов дает лучшую возможность в кинетической идентификации активных форм и агрегатов по сравнению с вышеперечисленными методами. Амплитудо-частотный анализ флюктуаций интенсивности рассеянного света в угле 9023^o позволил получить распределение по размерам образующихся агрегатов, но не дает возможности регистрировать активацию тромбоцитов (Ozaki Y; Satoh K; Yatomi Y; Yamamoto T; Shirasawa Y; Kume S. Detection of platelet aggregates with a particle counting method using light scattering. //Anal Biochem. -1994-V.218(2). P284-94). Прототипом к изобретению является способ, включающий получение обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) из крови, разбавление обогащенной тромбоцитами плазмы обедненной тромбоцитами плазмой, помещение разбавленной тромбоцитной плазмы в кюветное отделение фотометра, снабженного перемешивающим устройством, и измерение амплитудно-частотной характеристики интенсивности светорассеяния в 40^o угле, который позволяет независимо регистрировать активацию (не разделяя ее по стадиям) и агрегацию тромбоцитов [1].

Недостатками данного способа, принятого за прототип, являются невозможность проводить измерения при значениях ионов кальция в среде близким к физиологическим (около 1 mM) и невозможность использовать интенсивность светорассеяния для идентификации активационных стадий. Указанные недостатки обусловлены тем, что для разбавления обогащенной тромбоцитами плазмы использована обедненная тромбоцитами плазма.

Целью изобретения является разработка способа измерения активированных форм тромбоцитов для исследования ранее недоступных кинетических параметров 2-х стадий активации и исследования агрегации клеток при физиологической концентрации ионов кальция в среде, что позволяет расширить информационную ценность клинических, фармакологических и научных методов.

Поставленная цель достигается тем, что плазма разбавляется в 20-100 раз солевой средой с малым коэффициентом преломления и последующая регистрация интенсивности светорассеяния осуществляется в малых углах в условиях однократного рассеяния. Условия разбавления позволяют варьировать среду и проводить исследования при значениях концентрации ионов кальция в среде, близких к физиологическим (около 1 mM).

Предлагаемый способ поясняется фиг. 1-9.

Критерием оценки появления эффектов многократного рассеяния является отклонение от линейной зависимости рассеянного света и концентрации тромбоцитов. Зависимости интенсивности светорассеяния от концентрации неактивированных клеток в углах регистрации 1-15^o в кювете длиной 2 см в солевой среде (140 mM NaCl, pH 7,8 Трисбуфер, [Ca²⁺]_o-0,6 mM) в диапазоне концентрации клеток до 10⁷ кл/мл является линейной (при большей клеточности сказываются эффекты многократного рассеяния и зависимости теряет линейный характер) (см. фиг.1). Диапазон по концентрации клеток 10^5oC10⁷ кл/мл является существенным условием реализации предлагаемого способа. Величина сигнала интенсивности светорассеяния после добавления PRP пропорциональная концентрация клеток.

В наших условиях разбавления плазмы (PRP) агрегация тромбоцитов возможна только при условии добавления ионов кальция в среду (0,2-1 mM CaCl₂) и протекает, преимущественно, с образованием диаметров, т.к. является реакцией второго порядка по отношению к концентрации клеток. Это положение показано на фиг. 2.

Идентификации активационных стадий, агрегации и выбор углов регистрации светорассеяния сделан на основании исследования индикатрисс светорассеяния суспензии тромбоцитов в разных состояниях. На фиг. 3 представлен полулогарифмический вид индикатрисс рассеяния мономеров (дисков), полученных при внесении PRP в солевую среду: 140 mM NaCl, pH 7,8 трис-буфер, CaCl₂=0,6 mM и димеров (полученных при агрегации, вызванной 0,6 М АДФ). Полнота димеризации контролировалась следующими условиями: 1) агрегация (регистрируемая в 4%-ном угле) имеет быстрый (около 5 мин) экспоненциальный характер и при выходе на плато не имеет обратимого характера (т.е. дезагрегации и образования агрегатов с большим числом клеток не наблюдается; оба эти процесса вызывают уменьшение сигнала); 2) при выходе на плато добавка 3 М адреналина не вызывает изменения сигнала (все клетки активированы). Видно, что в диапазоне углов 5 - 6^o наблюдается инверсия сигнала. Удобным для регистрации агрегационного процесса является угол около 4^o, что дает величину отношения интенсивностей светорассеяния от димеров и от мономеров около 3 ^oC 4. Эта величина удобна для оценки полноты агрегационного процесса.

Первичная активация клеток (сферизация) связана с повышением внутриклеточной концентрации ионов кальция (Siess W.Molekular mechanisms of platelet activation. //Physiological Reviews -1989-V.69,N.1,58-178), что достигается действием агонистов (АДФ), действием кальциевых ионофоров или при изменении ионного состава среды. Нами было показано, что действие этих факторов проявляется только в динамике изменения интенсивности светорассеяния в диапазоне углов 9-16^o, тогда как изменения интенсивности светорассеяния в диапазоне углов 1-8^o не наблюдается. Действительно, в низких дозах АДФ (nM), иономицин (Ca-ионофор) (при 0,2 M) вызывает увеличение I¹² (интенсивности в 12-ти градусном угле) (фиг. 4), что позволяет связывать это увеличение со сферической клетки.

Устойчивая сферизация (что важно в регистрации индикатриссы) достигается при полной замене ионов натрия калиевыми в нашей среде (фиг. 5). Она характеризуется направленностью сигнала "Активации", сходной с той, которая проявляется под действием сильных агонистов в Na-среде, сигнал достигается того же уровня, однако скорости увеличения этого сигнала на порядок медленнее скорости, вызываемой агонистами (t_1/2 мин, по сравнению t_1/2 с в присутствии агонистов). Как видно фиг.5 в N⁺-среде спонтанной активации не наблюдается, а в K⁺-среде наблюдается спонтанная первая стадия активации (сферизация). В присутствии ЭДТА (1 mM) в KCl среде перехода не наблюдается (или он очень медленный) (фиг. 5).

Получив устойчивое сферическое состояние в KCl-среде, мы провели сравнение индикатрисс неактивированных клеток (дисков) (в NaCl-среде) и сферизованных (в KCl-среде). На фиг. 6 видно, что их индикатриссы совпадают в малых углах (3-8^o) и расходятся в более дальних углах (9-15^o). Иидикатриссы расходятся также около 1^o, но соотношение в сигналах при этом значительно меньше.

То, что в наших условиях разбавления плазмы агрегация невозможна в солевой среде без внесения свободного кальция в среду, можно удачно использовать для независимого исследования кривые светорассеяния тромбоцитов (концентрация клеток 210⁶ кл/мл) в солевой среде (140 mM NaCl, 12 mM Трисбуфер pH 7,8) при двух углах: 4 и 12^o, при внесении 0,6 M АДФ, с последующей добавкой CaCl₂ (0,6 mM), вызывающей агрегацию. Видно, что в отсутствии агрегации динамика сигнала в угле 12^o имеет двухфазный характер, что дает право связать ее с двумя реакциями: сферизацией клетки и образованием псевдоподий, а агрегация (как образование димеров) регистрируется в обоих углах, причем наблюдается инвертирование сигнала в 12-ти градусном угле при сохранении временных показателей в обоих углах регистрации.

Тромбоциты с псевдоподиями ("ежики"), т.е. способные к агрегации после внесения кальция в среду, и неактивированные (диски) дают совпадающие индикатриссы и отличаются только флюктуацией сигнала.

Таким образом одновременная регистрация интенсивности светорассеяния в двух углах (около 4 и 12^o) суспензии тромбоцитов в солевой среде (с малым коэффициентом преломления) позволяет провести идентификацию активационных стадий и агрегации. На фиг. 8 показана поэтапная схема получения тромбоцитов в разных состояниях. Помещение клеток в KCl-среду (без добавления кальция) переводит тромбоцит в сферизованное состояние, добавка насыщающей концентрации АДФ (около 1 M) позволяет тромбоцитам образовать псевдоподий и, наконец, внесение кальция в среду (около 1 mM) вызывает агрегацию клеток. Обратный порядок эксперимента позволяет определить процентную долю клеток в разных состояниях. Диагностическая ценность такого определения подтверждена многими работами (напр. Шитикова А.С. Изменение формы тромбоцитов как показатель их внутрисосудистой активации. В сб. "Клинико-лабораторная диагностика предтромбоза и тромботических состояний", С-Петербург: 1991, с.38-52).

Пример. Получение обогащенной плазмы тромбоцитов из венозной донорской крови кроликов методом дифференциального центрифугирования с использованием в качестве антикоагулянта 3,2%-ного цитрата натрия (pH 6,0).

Разбавление обогащенной тромбоцитами плазмы в 50 раз KCl-средой (140 mM KCl, 10 mM Трис-Cl буфер (pH 7,8)) при этом наблюдается сферизация тромбоцитов. После чего тромбоциты кроликов приобретают способность агрегировать под влиянием адреналина (в NaCl - среде тромбоциты не чувствительны к действию адреналина). Получив фиксированное (достаточно устойчивое) состояние начальной активации тромбоцитов в K⁺ среде (устойчивый "шарик"), проводят кинетическое исследование второй стадии активации (формирование "ежика"). Далее проводится графическая обработка результатов этих экспериментов методом Вульфа (зависимость I от I/S , что позволяет получить, оценить параметры связывания адреналина и блокирования связывания антагонистами : иохимбином ( ₂ -адреноблокатор) и пропранололом ( -адреноблокатор) сходные с данными полученными радиолигандным методом (анализ по Скэтчарду) (Bylund D.B.(1994). На фиг. 9 (зависимость I¹² от I¹²/ [адреналин]) представлен графический анализ параметров связывания адреналина, и его блокирования пропранололом и иохимбином. Для обоих блокаторов видно, что тип ингибирования - конкурентный, а вычисленные значения для адреналина - K_м (EC₅₀) 1,5 M (концентрация медиатора, необходимая для достижения половины максимального эффекта), для иохимбина - K_i 50 nM (концентрация блокатора, необходимая половинного подавления связывания медиатора), для пропранолола - K_i 3 M, т. е. селективность иохимбина ( ₂ -адреноблокатора) на два порядка выше пропранолола ( -адреноблокатора). Значения K_i для иохимбина близким к величине K_D (Авдонин П.В. (1994)) и принятому мнению о наличии в тромбоцитах преимущественно ₂ - адренорецептора, характерной особенностью которого является сопряженность с G_i-белком, который вызывает угнетение аденилатциклазы.

Из приведенного примера осуществления изобретения видно, как предлагаемый способ может быть использован для тестирования фарм-препаратов.

Представленные данные свидетельствуют о том, что использование (изобретения обеспечивает возможность: измерения активированных форм тромбоцитов; исследовать кинетические параметры активации для оценки токсинов и лекарственных препаратов; научных задач по организации сигнальных систем клеток, особенность функционирования тромбоцитов при различных заболеваниях.