фрагмент днк, соответствующий гену skc-2, способ экспрессии фрагмента днк, соответствующего гену skc-2, плазмидный вектор pek g3, обеспечивающий экспрессию фрагмента днк, соответствующего гену skc-2, плазмидный вектор pes kc-4, обеспечивающий экспрессию фрагмента днк, соответствующего гену skc-2, штамм бактерий escherichia coli, содержащий плазмидный вектор pekg3 и используемый для экспрессии гена skc-2, и стрептокиназа, полученная при использовании штамма бактерий escherichia coli hsk-m

Формула изобретения

1. Фрагмент ДНК, соответствующий гену SКС-2, кодирующему стрептокиназу из штамма бактерий Streptococcus equisimilis группы С АТСС 9542, имеющий структуру, приведенную на с.

2. Способ экспрессии фрагмента ДНК, соответствующего гену SКС-2, кодирующему стрептокиназу из бактерий Streptococcus equisimilis группы С АТСС 9542, имеющего структуру по п.1, заключающийся в том, что указанный ген амплифицируют с помощью синтетических олигонуклеотидов SK1, SK2 и SK3 следующего строения:

(SК1) 5" TGGAATTCTATGAAAAATTACTTATCT...3"

(SK2) 5" TGGATCCTTATTTGTCGTTAGGGTTATC...3"

(SK3) 5" GGAATTCATGATTGCTGGACCTGAGTGGCTG...3",

клонируют его, встраивают в плазмидный вектор, с помощью которого трансформируют компетентные штаммы бактерий Escherichia coli или дрожжей Pichia pastoris, выращивают трансформированные штаммы в культуральной среде и определяют уровень экспрессии указанного гена.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве трансформированного штамма бактерий Escherichia coli выращивают штамм E.coli HSK-M, содержащий плазмидный вектор рЕКG3.

4. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве трансформированного штамма дрожжей Pichia pastoris выращивают штамм P.pastoris, содержащий плазмидный вектор pESKG4.

5. Плазмидный вектор рЕКG3, обеспечивающий экспрессию фрагмента ДНК, соответствующего гену SKC-2, кодирующему стрептокиназу из бактерий Streptococcus equisimilis группы С штамма АТСС 95242, имеющего структуру по п.1, в клетках штамма Escherichia coli HSK-M, характеризующийся следующими признаками:

- имеет размер 3,7 кб;

- содержит триптофановый промотор E.coli в составе Sca I - Cla I-фрагмента;

- содержит указанный ген SKC-2 в составе Ecor I - Bam HI-фрагмента;

- содержит терминатор бактериофага Т4 в составе Bam HI - Hind III-фрагмента;

- содержит ген устойчивости к ампициллину;

- имеет уникальные сайты рестрикции для эндонуклеаз Cla I, EcoR I, Bam HI, Hind III.

6. Плазмидный вектор pESKC - 4, обеспечивающий экспрессию фрагмента ДНК, соответствующего гену SKC-2, кодирующему стрептокиназу из бактерий Streptococcus equisimilis группы С штамма АТСС 9542, имеющего структуру по п.1, в клетках штамма Pichia pastoris MSK-M 4, характеризующийся следующими признаками:

- имеет размер 10,1 кб;

- содержит промотор гена алкогольоксидазы (АОХ1) в составе EcoRI - Hind III-фрагмента;

- содержит ген сигнального пептида сахарозной инвертазы (SUC 2);

- содержит указанный ген SKC-2, фланкируемый нетранслируемыми 5"- и 3"-последовательностями гена АОХ 1 Pichia pastoris;

- содержит сигнал терминации гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы дрожжей Saccharomyces cerevisiae;

- содержит ген гистидина 3 дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве маркера селекции;

- содержит ген устойчивости к ампициллину;

- имеет уникальные сайты рестрикции для эндонуклеаз NCOI, EcoR I.

7. Штамм бактерий Escherichia coli HSK-M, содержащий плазмидный вектор рЕКG3, и используемый для экспрессии гена SKC-2, кодирующего стрептокиназу из штамма бактерий Streptococcus equisimilis группы С АТСС 9542, имеющего структуру по п.1.

8. Стрептокиназа, полученная при использовании штамма бактерий Escherichia coli HSK-M, содержащего плазмидный вектор рЕSG3, обеспечивающий экспрессию фрагмента ДНК, соответствующего гену SKC-2, кодирующему стрептокиназу из бактерий Streptococcus equisimilis группы С штамма АТСС 9542, имеющего структуру по п.1, обладающая следующими свойствами:

- мол. м. 47000 Da;

- биологическая активность 50000 - 100000 МЕ/мг, определенная на агарозо-фибриновых пластинах, на хромогенном субстрате и методом лизирования тромба in vitro;

- аминокислотная последовательность, приведенная на с.

которая на 100% совпадает с аминокислотной последовательностью, выведенной на основе гена SKC-2.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Оно, в частности, состоит в разработке способа выделения и клонирования новой нуклеотидной последовательности, кодирующей стрептокиназу, а также в получении с ее помощью рекомбинантных ДНК, которые используются для трансформации различных организмов-хозяев.

Стрептокиназы - это активаторы плазминогена с мол. массой около 47 кВа, вырабатываемые в прокариотических клетках и обычно выделяющиеся в питательную среду многими гемолитическими стрептококками.

Механизм патогенного воздействия стрептокиназы до конца еще не выяснен, предположительно она должна способствовать уничтожению фибриновых покрытий вокруг инфекции или препятствовать их образованию.

Известно, что при взаимодействии с плазминогеном плазмы человека стафилококковая стрептокиназа способна превращать плазминоген в плазмин, обладающий протеолитической активностью и способностью превращать фибриновые сгустки в растворимые продукты.

В связи с этим стрептокиназа наряду с урокиназой и тканевым активатором плазминогена в настоящее время используется в качестве тромболитического средства при лечении заболеваний, являющихся одной из главных причин смертности в мире, таких, как инфаркт миокарда, легочная, артериальная или венозная тромбоэмболия, хирургические осложнения и другие случаи тромбозов.

Отмечаются химико-физические и иммунологические различия, а также различия в субстратной специфичности, которые свидетельствуют о молекулярной неоднородности стрептокиназ различного происхождения, хотя все они весьма схожи между собой по функциям.

Наряду с низким выходом стрептокиназы при ее получении из стрептококка и патогенностью естественного хозяина к недостаткам производства фермента этим методом относится то, что штаммы стрептококка, используемые для промышленного производства стрептокиназы, выделяют в питательную среду другие побочные продукты (дезоксирибонуклеазу, стрептолизин или гиалуронидазу, протеазы), что усложняет процесс ее очистки.

Ввиду отсутствия подходящей методики их генетической обработки до сих пор не удалось получить генетически улучшенные штаммы стрептококков.

Для устранения вышеперечисленных недостатков были предприняты попытки клонирования различных выделенных генов, кодирующих стрептокиназу, с использованием прокариотических и эукариотических клеток-хозяев.

Патент ГДР N 249493, CIP:012N15/00 содержит описание клонирования и экспрессии гена, кодирующего стрептокиназу из штамма Streptococcus equisimilis Н46А, относящегося к группе C, с использованием в качестве клетки-хозяина бактериальной клетки E.coli. При этом удалось получить уровни выделения фермента в среду от 0,1 до 1,8 мг/л, в зависимости от возраста культуры.

Позднее была определена нуклеотидная последовательность, соответствующая этому гену, названному SKC (с сигнальным пентилом), а также расшифрована первичная структура фланкирующих участков, ответственных за контроль транскрипции и трансляции данного гена (Malke, Н. и др., 1985).

Были охарактеризованы нуклеотидные последовательности и других генов, кодирующих стрептокиназу и полученных из стрептококков групп G и A (Walter, F и др. , 1989). В частности ген, кодирующий стрептокиназу группы A (ген SKA), полученный из штамма 49М Streptococcus piogenes, клонировался и экспрессировался в штамме JM109. Ecoli и штамм Strqtococcus sanguis Challis 57Е (Huang, T. и др., 1989). Полученный при этом выход белка составил, соответственно 0,64 мг/л и 40 мкг/л. В случае использования E.coli 94% полученного белка находилось в периплазмическом пространстве, а 6%-в цитозоле, тогда как в случае S sanguis весь белок располагался вне клетки. Однако многие клоны, предназначенные для экспрессии стрептокиназы в E.coli, были весьма неустойчивыми.

При получении в S sanguis молекула белка имела молекулярный вес примерно на 3000 дальтон меньше, чем природная стрептокиназа. Кроме того, в ней обнаружили отсутствие 32 аминокислот со стороны C-конца, что, однако, не сказалось на ее биологической активности (Huang, T. T. и др., 1989).

Полученные результаты показали, что выделенный ген SKC чрезвычайно трудно клонировать и экспрессировать в клетках E.coli, ибо генный продукт препятствует нормальной физиологической деятельности клетки-хозяина. Это подтверждалось и фактурой клеток, несущих в себе этот ген, и неполным переносом стрептокиназы в периплазматическое пространство, и структурной нестабильностью плазмид-носителей гена SKC, предназначенных для высоких уровней экспрессии белка, а также сложностью клонирования генов стрептокиназы некоторых групп стрептококка в плазмидах из E.coli и, наконец, неудачными попытками добиться экспрессии чужеродных генов под контролем сигналов эксперсии- секреции самого гена SKC (Muller, J. и др., 1989).

Недавно компания Phillips Petroleum (DD 257646, CIP: C 12 N 15/00 и Haggenson, M.J. и др., 1989) добилась экспрессии стрептокиназы в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris под контролем регуляторных последовательностей гена алкогольдегидрогеназы (АДГ). Этот процесс, в котором использовалась непрерывная ферментация, позволил получить выход стрептокиназы порядка 77-250 мг на литр питательной среды со средней клеточной плотностью 46 г/л.

В качестве векторов экспрессии применялся ген SKC в составе плазмиды pMF5, запатентованной доктором Дж.Дж. Феретти из Оклахомского университета США на имя вышеупомянутой компании.

Привлекательной эту систему делает ее регулируемость и несложность ее подавления глюкозой или глицерином и индуцирования метанолом. Вместе с тем ее применение ограничивается клетками-хозяевами Pichia pastoris.

Изобретение имеет целью получение высокого выхода стрептокиназы в различных хозяйских клетках посредством использования векторов экспрессии с новой нуклеотидной последовательностью, соответствующей последовательности описанного ранее гена, кодирующего биоактивную стрептокиназу из штамма АТСС-9542 Streptococcus equisimilis группы С. Новый выделенный ген, названный SKC-2, кодирует белок того же молекулярного веса, что и ген SKC. Главной характеристикой ДНК-последовательности названного гена является стабильность ее в векторах E. coli и дрожжей, а также отсутствие отрицательного воздействия продукта на рост клетки или на ее жизнеспособность, что позволяет получить более высокий выход фермента по сравнению с описанными до настоящего времени в литературе. При этом продукт, полученный в клетках-хозяевах обоего типа, представляет собой стрептокиназу, отличную от до сих пор известных ее вариантов и обладающую высокой биологической активностью.

Предметом изобретения является способ получения и экспрессии новой нуклеотидной последовательности, соответствующей гену SKC-2, продуктом которого является белок с молекулярным весом порядка 47000 дальтон, обладающий фибринолитической активностью.

Новый ген имеет следующую нуклеотидную последовательность:

1

ATTGCTGGACCTGAGTGGCTGCTAGACCGTCCATCTGTCAACAACAGCCAATTAGTTGTT

AGCG

65

TTGCGGTACTGTTGAGGGGACGAATCAAGACATTAGTCTTAAATTTTTTGAAATTGACCT

AAC

129

ATCACGACCTGCTCATGGAGGAAAGACAGAGCAAGGCTTAAGTCCAAAATCAAAACCATT

TGCT

193

ACTGATAGTGGCGCGATGCCACATAAACTTGAAAAAGCTGACTTACTAAAGGCTATTCAA

GAAC

257

AATTGATCGCTAACGTCCACAGTAACGACGACTACTTTGAGGTCATTGATTTTGCAAGCG

ATGC

321

AACCATTACTGAAACGGCAAGGTCTACTTTGCGACAAAGATGGTTCGGTAACCTTGCCG

385

ACCCAACCTGTCCAAGAATTTTTGCTAAGCGGACATGTGCGCGTTAGACCATATAAAGAA

AAAC

449

CAATACAAAATCAAGCGAAATCTGTTGATGTGGAATATACTGTACAGTTTACTCCCTTAA

ACCC

513

TGATGACGATTTCAGACCAGGTCTCAAAGATACTAAGCTATTGAAAACACTAGCTATCGG

TGAC

577

ACCATCACATCTCAAGAATTACTAGCTCAAGCACAAAGCATTTTAAACAAAACCCACCCA

GGCT

641

ATACGATTTATGAACGTGACTCCTCAATCGTCACTCATGACAATGACATTTTCCGTACGA

TTTT

705

ACCAATGGATCAAGAGTTTACTTACCATGTCAAAAATCGGGAACAAGCTTATGAGATCAA

TAAA

769

AAATCTGGTCTGAATGAAGAAATAAACAACACTGACCTGATCTCTGAGAAATATTAAGTC

CTTA

833

AAAAAGGGGAAAAGCCGTATGATCCCTTTGATCGCAGTCACTTGAAACTGTTCACCATCA

AATA

897

CGTTGATGTCAACACCAACGAATTGCTAAAAAGCGAGCAGCTCTTAACAGCTAGCGAACG

TAAC

961

TTAGACTTCAGAGATTTATACGATCCTCGTGATAAGGCTAAACTACTCTACAACAATCTC

GATG

1025

CTTTTGGTATTATGGACTATACCTTAACTGGAAAAGTAGAGGATAATCACGATGACACCA

ACCG

1089

TATCATAACCCTTTATATGGGCAAGCGACCCGAAGGAGAGAATGCTAGCTATCATTTAGC

CTAT

1153

GATAAAGATCGTTATACCGAAGAAGAACGAGAAGTTTACAGCTACCTGCGTTATACAGGG

ACAC

1217

CTATACCTGATAACCCTAACGACAAATAA

LSI

Фрагмент ДНК с указанной последовательностью также является предметом изобретения. Он получен из генома штамма Streptococcus eguisimilis группы C (штамм ATCC-9542) посредством генной амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (PCR), в которой использовались три синтетических олигонуклеотида, названные SK1, SK2 и SK3 и обладающие следующими последовательностями:

SK1 5"... TGGAATTCTATGAAAAATTACTTATCT...3"

SK2 5"... TGGATCCTTATTTGTCGTTAGGGTTATC...3"

SK3 5"..... GGAATTCATGATTGCTGGACCTGAGTGGCTG...3".

Они представляют собой элемент новизны в этом процессе. Кроме того, на этих затравках располагаются сайты рестрикции, которых нет в гене и которые позволяют проводить клонирование непосредственно в векторе экспрессии. С другой стороны, на 5"-конце SK2 несет кодон ATG, который служит местом начала трансляции и элиминирования сигнального пептида. Все три олигонуклеотида были синтезированы на основе последовательностей SKC, опубликованных Мальке и группой соавторов в 1985 г. На этой основе точно были определены фрагмент гена, кодирующий зрелый белок, и полная последовательность, кодирующая предшественник с сигнальным пептидом.

Другим моментом новизны данного способа является возможность экспрессии выделенного гена как в бактериях, так и в дрожжах, причем в обоих случаях достигаются высокие уровни экспрессии.

Рекомбинантные плазмидные ДНК, включающие ген SKC-2, также составляют предмет изобретения, и особенно векторы для экспрессии этого гена в бактериях pEKG3 (фиг. 1), и в дрожжах, pPESKC-4 (фиг. 3). В частности, экспрессия в клетках E.coli SKC-2 с сигнальным пептидом или без него клонируется под контролем триптофанового промотора и терминатора транскрипции фага T4. Для дрожжей был использован вектор экспрессии, представленный в заявке на авторское свидетельство за номером 7/90, (Cu), в который вслед за сигнальным пептидом гена Sacarosa Invertasa (CU C2), был введен ген SKC-2, регулируемый промотором гена алкогольоксидазы Pichia pastoris и сигналом терминации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPt) дрожжей Saccharomyces cerevisiae (для варианта внеклеточной экспрессии). В качестве маркера селекции был использован ген HIS3 дрожжей 8, cerevisiae. Этот вектор был назван pPESKC-4.

Предметом изобретения также являются рекомбинантные штаммы, полученные в результате трансформации штамма E.coli W3110 вектором pEKG3 и мутанта MP-36 Pichia pastoris, представленного в заявке на авторское свидетельство 7/90, вектором экспрессии pPESKC-4, и отличающиеся высокими уровнями экспрессии стрептокиназы и высокой жизнеспособностью (продукт не сдерживает клеточный рост) и устойчивостью.

Способ, составляющий предмет изобретения, отличается высоким уровнем экспрессии, не достигавшимся ранее в отношении этого продукта, а также высокой степенью чистоты фермента, которая позволяет применять его на людях или животных, не прибегая к сложным и дорогостоящим процессам очистки.

Нижеприведенные примеры иллюстрируют, но отнюдь не ограничивают возможности данного изобретения. В этих примерах в качестве систем- хозяев используются E. coli и Pichia pastoris. Однако описанный в изобретении метод дает возможность использовать в качестве клеток-хозяев также и другие эукариотические и прокариотические клетки.

Пример 1. При клонировании гена SK в целях выделения геномной ДНК Streptococcus eguisimilis группы C, в качестве ее источника использовали штамм ATCC-9542. Клетки Streptococcus eguisimilis выращивались в среде Brain Hear Infusion Medium (GIBCO). Выращивание производилось в условиях центрифугирования со скоростью 240 об/мин в течение 12 ч. при температуре 37^oC. На этом этапе получали 5 мл культуры, которую использовали при получении затравки для ферментирования в колбе Эрлермеера на 300 мл. Содержимое колбы культивировалось в течение 12 ч., затем клетки отделяли центрифугированием со скоростью 3000 об/мин и ресуспендировали в 8 мл сложного раствора (4,5 г глюкозы, 1,86 EDTA и 1,51 г Трис HCl в 500 мл стерильной воды при pH=8), после чего проводилось добавление 80 мл лизоцима концентрацией 10 мг/мл и инкубация в течение 30 мин при температуре 37^oC. Затем для достижения эффективного разрыва (разрушения) клеток добавляли 500 мл проназы (Boehringer), 1 мл 10%-ного SDS и 200 мл EDTA 0,5M, pH=8. Смесь инкубировалась в течение 2 ч. при 50^oC и перемешивании. Затем последовательно производилась обработка фенолом, фенол-хлороформом, хлороформом. Геномную ДНК осаждали при помощи абсолютного (100%-ного) этанола и 7,5M NH₄Ac. Выход составлял 100 г на колбу Эрлермеера с 300 мл культуры. Наличие гена, кодирующего стрептокиназу, было подтверждено техникой Soutern Blot (Maniatis и др., 1982).

Пример 2. Для субклонирования в бактерии брался 1 г полученной в пр.1 ДНК Streptococcus eguisimilis и посредством PCR амплифицировался ген, кодирующий SKC-2. (Randall и др., 1988). При этом для клонирования гена с сигнальным пептидом использовались олигонуклеотиды SK1 и SK2, а для клонирования гена без этого пептида - олигонуклеотиды SK2 и SK3. Для каждой реакции использовались 100 пикомолей каждого олигонуклеотида, 2 единицы Tag-полимеразы (Pelkin-Elmer США), 200 молей каждой dNTP. Реакция проводилась в 10 mM MgCl₂, 100 mM NaCl, 100 г/мл желатина. Было проведено 30 циклов амплификации. В каждом из них смесь инкубировали 1 мин при температуре 95^oC в целях денатурации, 45 с при температуре 52^oC в целях гибридизации олигонуклеотидов и 80 с при температуре 70^oC в целях размножения. При соблюдении этих условий эффективность амплификации возрастала более чем на 5%.

Для клонирования в бактерии (E.coli) использовалась генетическая конструкция, отличная от предлагавшихся для экспрессии этого продукта ранее. В этой конструкции использовался триптофановый промотор из E.coli и сигнал терминации из бактериофага T4.

Амплифицированные посредством PCR фрагменты были расщеплены рестриктазой BamHI и присоединены к вектору ptrip-Ncol-S1-BamHI(Estrada и др., 1988). Эта конструкция была введена в препарат компетентных клеток, приготовленных (по Dagert и др., 1974 и Hanahan и др., 1983) из штамма E.coli HBIOI (rB ^mB-), supE₄₄, ara-14, gaIK-2, IacVI:proA2, rps120, (str_p, xyI-5, mt1-I, reoAI3, которые характеризовались частотой, превышающей 10⁷ трансформантов на микрограмм ДНК. Полученные колонии были реплицированы на пластинках со средой LB (триптон 10 г/л, экстракт дрожжей 5 г/л, хлористый натрий 10 г/л) и 50 г/мл ампицилина, после чего гибридизированы по Maniatis и др., 1982. При этом в качестве зонда использовали фрагмент, полученный в результате амплификации с помощью полимеразной цепной реакции (PCR) и маркированный dATP₃₂ (Amersham, UK). 4% колоний составили положительные клоны, которые были подвергнуты рестрикционному анализу и показали одну и ту же картину гидролиза с более чем 10 рестрикционными ферментами. Кроме того, позитивные клоны были проверены путем определения последовательности двухцепочной ДНК (Sanger и др., 1977), с использованием олигонуклеотида из 17 оснований (5"...ATCATCGAACTAGTTAA... 3"), который гибридизировался с 3"-концом промотора, что подтверждало наличие у последнего ожидаемой связи с геном SKC-2.) Отобранный клон, обозначенный как pEKG3 (фиг. 1), был использован в процессе ферментации с целью характеристики продуктов. Была произведена очистка плазмиды клона pEKGЗ с использованием градиента CsCl и получена последовательность гена SKC-2. При этом всегда брали 2 г плазмиды и использовали в качестве затравки приводимые ниже олигонуклеотиды:

SSK-01 5"... GAATCAAGACATTAGTC... 3"

SSK-02 5"... GTGGCGCGATGCCAC... 3"

SSK-03 5"... GCAACCATTACTGATCG... 3"

SSK-04 5"... CCAGTACAAAATCAAGC... 3"

SSK-05 5"... CTAGCTATCGGTGACAC... 3"

SSK-06 5"... CAGAGATCAGGTCAG... 3"

SSK-07 5"... GTTAAGAGCTGCTCGC... 3"

SSK-08 5"... CCAGTTAAGGTATAGTC... 3⁶

SSK-09 5"... TCTCGTTCTTCTTCGG... 3"

Главным образом применялась процедура по Sanger и др., 1977, с использованием dATP32 и S35dATP (Amersham, UK).

На фиг. 2 сравниваются аминокислотная последовательность, выведенная из нуклеотидной последовательности гена SKC-2, и последовательности генов SKC (Malke и др., 1986), SKA и SKG (Walter, F и др., 1989).

Пример З. Плазмидой pEKG3 было трансформировано несколько штаммов E.coli: W-3110, JM-101, LE392, MC-1061. Наилучшие результаты были получены по штамму W-3110 (F-supF supEhsdRgalKTrpRmet Black YtonA), в связи с чем он был отобран для крупномасштабной ферментации и дал устойчивый уровень экспрессии, превышающий 20% всего белка клеток.

Штамм E. coli W3110 Морфологическая характеристика: бактерии, грамм-отрицательные, выращенные на твердой среде; колонии неправильной формы, края в виде мелких лопастей, кремообразной консистенции.

Рекомбинантный штамм E.coli HSK-M. Имеет те же морфологические характеристики. Условия роста и индукция trp промотора: клетки E.coli для продукции рекомбинантной стрептокиназы выращивались в 5л-ферментере, содержащем 1%-ный гидролизат (кислый) казеина, 0,5%-ный дрожжевой экстракт, 55 мМ глюкозу, 20 мг триптофана/л, 8 мМ хлорид калия, 18 мМ хлорид аммония, 22 мМ двухосновный фосфат калия, 16 мМ одноосновный фосфат натрия, 100 мг ампициллина/л, pH 6,85-7,15. Бактерии выращивались при 37^oC и 750 rpm в течение 24 ч. В первые 6 ч. роста культура пополнялась 5-кратно концентрированной средой с постоянной скоростью; максимальный выход 50 г биомассы/л культуры был получен через 16 ч. Максимальный уровень экспрессии рекомбинантной стрептокиназы (350 мг/л и более) достигался через 14 ч. Для очистки рекомбинантной стрептокиназы клетки осаждали и разрушали ультразвуком. После нескольких промывочных стадий частично очищенный белковый препарат был хроматографирован на аффинной колонке с плазминогеном. Для приготовления колонки около 6 мг плазминогена человека были связаны с 1 мл геля цианогенбромид - активированной сефарозы 4B (Pharmacia - LKB, Sweden.), согласно рекомендациям производителя. Плазминоген был добавлен к смоле в 0,1 M NaHCO₃, pH 8,3. Колонка уравновешивалась 0,01 м трис-HCl pH 8,0. Иммобилизованный плазминоген был обработан 0,5 мМ NPGB (Sigma, St.Louis, MO) в 0,01 M трис-HCl, pH 8,0 на мл геля. Белок был нанесен на колонку, и колонка была промыта буфером, содержащим 0,01 M трис-HCl, 1 M NaCl, pH 8,0. Белок, элюированный с плазминоген-сефарозной колонки, был затем пропущен со скоростью 400 мл/ч. через 100 мл - колонку с DEAE-Sephacel (Pharmacia - LKB, Sweden), предварительно уравновешенную 0,01 M трис-HCl, pH 8,5. После промывки колонки уравновешивающим буфером стрептокиназа элюировалась 0,1 M градиентом NaCl со скоростью 20 мл/ч. Для определения продуктивности штаммов использовались хорошо известные методы: электрофорез в SDS - полиакриламидном геле и Вестерн-блот анализ. В Вестерн-блот анализе очищенный материал анализировался с применением поликлональной кроличьей антисыворотки против стрептокиназы (Kabikinase, Kabi Vitrum, Sweden).

Активность белка определялась тремя методами.

а) Метод казеин/плазминогеновых пластин (плат). 10 мл 0,05 M трис-HCl pH 8,1/0,002M NaCl, содержащего 100 мг агарозы (Sigma, USA) и 6 г плазминогена человека (Sigma) смешивали с 1,5 мл 10%; снятого молока (Difco). В пластах были сделаны лунки диаметром 2 мм и в каждую из них помещено по 4 мкл образцов. Платы инкубировались в увлажненной камере при 37^oC в течение 12 ч. Активность стрептокиназы рассчитывалась из кривой зависимости квадратичного диаметра зоны лизиса казеина от содержания фермента (ед/мл) для каждого образца.

б) Анализ с применением хромогенного субстрата (S-2251). Анализ с применением хромогенного субстрата (S-2251) был использован для определения активности стрептокиназы в ферментационной культуре и очищенных образцах. Метод основан на образовании стехиометрического комплекса между стрептокиназой и плазминогеном и обеспечивает детекцию таких малых величин, как 7 международных единиц/мл.

Метод дизиса тромбов in vitro. Метод рекомендован Британской фармокопеей в 1980 г. для определения эффективности препаратов стрептокиназы в качестве лекарства. Он определяет международную единицу стрептокиназы, используя концентрацию стрептокиназы (1V/мл) против логарифма времени лизиса тромба. Метод используется для оценки активности конечного продукта. Определение активности названными методами дало сходные результаты.

Пример 4. Для субклонирования гена SKC-2 в дрожжах в качестве клетки - хозяина брали штамм MP-ЗО Pichia pastoris. Были осуществлены варианты клонирования для внутриклеточной и внеклеточной экспрессии на основе плазмид pNAO и pPS7 (фиг. 3) с использованием для внеклеточной конструкции сигнального пептида гена сахарозы-инвертазы. В обоих случаях ген клонировали под контролем промотора гена алкогольоксидазы (AO) и использовали в качестве терминатора на 3"-конце сигнал терминации гена глицеральдегид-3-фосфат-дигидрогеназы дрожжей S. cerevisial, а также 3"-некодирующую область AO для гомологичной интеграции в дрожжевой геном; помимо этого, использовали ген, кодирующий гистидин-З в качестве маркера селекции в штамме MP-36 his. Для внеклеточной экспрессии белка был получен вектор pPESKC4 на основе объединения вектора pPS7-Ncol-Sl Nucleasa-Fosfatasa с геном SKC-2, амплифицированным путем полимеразной цепной реакции (PCR) на основе pEKC3 и при посредстве олигонуклеотида SK2, а также новой затравки, которая гибридизируется с 5"-концом гена (при этом элиминирует кодон ATG, ранее введенный в плазмиду для экспрессии в бактериях). Полученным вектором трансформировали штамм MP-36 his с применением процедуры по Gregg I. и coabt., 1985. Положительные клоны были изучены методом Southern blot (Maniatis Y cols., 1982). Из клонов с правильной интеграцией были отобраны наиболее продуктивные для получения и характеристики продукта. При внеклеточной экспрессии рекомбинантной стрептокиназы, полученной в P. pastoris, ее выход составил 2-1-1,2 г на литр питательной среды, а в случае внутриклеточной экспрессии - свыше 1,0 г на л питательной среды. В конструкции для внеклеточной экспрессии был получен гликозилированный белок с молекулярным весом, превышающим 67000 дальтон. Методом Western blot было установлено, что молекулярный вес, характерный для природной стрептокиназы, получается при ее расщеплении эндогликозидазой H. Для этого бралась фракция с концентрацией 1 мг/мл в растворе цитрата натрия 0,05M, pH=5,5 и денатурировалась путем добавления 808 (конечная концентрации 0,02%) и нагревания до 100^oC в течение 10 мин. Затем пробу охлаждали до комнатной температуры и добавляли 20 миллиединиц эндогликозидазы H (Endo H), после чего выдерживали в течение 16 ч. при 37^oC. После этого производилось нагревание до 100^oC в течение 5 мин, добавление 10 миллиединиц Endo H с последующей инкубацией в течение 12 ч. при температуре 37^oC. Введение препарата в 12,5%-ный полиакриламидный гель и его сравнение с обработанным образцом подтвердило вывод об увеличении мол. веса за счет избыточного гликозилирования. Стрептокиназа, произведенная Pichia pastoris на обоих конструкциях, сохраняет биологическую активность и не теряет своего сродства к плазминогену.

Пример 5. Для проверки биологической активности продукта гена SKC-2 чистая рекомбинантная стрептокиназа из дрожжей, полученная как в бактерии (см. выше) была использована в исследованиях по острой и подострой токсикологии на мышах. При этом были получены удовлетворительные результаты, позволяющие использовать ее в терапевтических целях на людях и животных. Ее фибринолитическая активность in vivo проверялась путем клинических испытаний на животных, в ходе которых удалось растворить тромбы в венечной (a. coronaria) и бедренной (a. femoralis) артериях собак с соблюдением параметров крови, описанных в литературе, посвященной этому виду продуктов. Продукт гена SKC-2 характеризовался специфической активностью от 50000 до 100000 МЕ/мг, измеренной методами, описанными в примере 3.

Пример 6. Для проверки аминокислотной последовательности, "выведенной" из нуклеотидной последовательности гена SKC-2, был проведен анализ чистого продукта при помощи высокоразрешающей жидкостной хроматографии с обращенной фазой (HPL C-RP) в колонке C8 4,6250 мм (Baker, VS) с использованием градиента от 0% буфера B (при 90% буфера A) через 5 мин до 90% буфера B (при 0% буфера A) через 55 мин. Буфер A - 0,1%-ная трифторуксусная кислота (TFA) (Pierce, VS) в дистиллированной воде, буфер B - 10,5%-ная трифторуксусная кислота в ацетонитриле (Lichrosolv, Merck, RFA); скорость потока 0,8 мл/мин. Аминокислотная последовательность, выведенная на основе ДНК- последовательности, полученной для гена SKC-2, была также проверена секвенированием (sequencing) на масс-спектрометре с применением белка высокой степени чистоты. Для этого белок расщеплялся различными ферментами и их сочетаниями. Использовались следующие ферменты: химотрипсин, энодопротеиназа Clu-C, энодопротеиназа Lys-Cy и трипсин. После масс-спектрометрического анализа пептидов методом наложения была составлена карта аминокислотной последовательности белка, которая подтвердила, что в данном случае существует 100%-ное соответствие между последовательностью гена SKC-2 и аминокислотной последовательностью полученного белка.

Описание последовательности SEQ ID NO:1

Тип последовательности: нуклеотидная и соответствующая белковая.

Длина последовательности: 1245 п.о.

Количество цепей: одна.

Топология: линейная.

Молекулярный тип: геномная ДНК.

Организм-источник: Str. equisimilis группы C.

Непосредственный источник: штамм ATCC-9542.

Свойства: зрелый пептид 1-1245 п.о.

Свойства продукта:

ген стрептокиназы;

продукт гена связывает плазминоген человека;

продукт гена является активатором плазминогена человека.