способ определения раундапа в биологических объектах

Формула изобретения

Способ определения раундапа в биологических объектах, включающий экстракцию его растворителем с последующим выпариванием, нанесением проб на тонкий слой сорбента пластинок "Силуфол", разгонку и идентификацию проявляющим реагентом, отличающийся тем, что в качестве растворителя в процессе экстракции используют хлороформ, предварительно насыщенный гидроксидом натрия, после экстракции проводят выпаривание, пробы наносят на пластинки холодным 50% -ным водным раствором ацетона, а разгонку осуществляют в смеси метанола, ацетона и ледяной уксусной кислоты в объемном соотношении 80 20 8 и для идентификации в качестве проявляющего реагента используют смесь равных объемов 2%-ного раствора нитрата серебра и 0,4%-ного раствора бромфенолового синего.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к санитарии и токсикологии и может быть использовано для санитарно-токсикологической оценки продуктов животноводства, содержащих остаточные количества гербицида, а также для прижизненной и посмертной диагностики случайных острых отравлений животных и человека данным препаратом.

Рундап-N-/фосфонометил/ глицин структурной формулы



широко используется в качестве гербицида избирательного и сплошного действия для подавления однолетних и многолетних сорняков, в частности пырея ползучего, вьюнка, мышея и др. а также проходит испытания в качестве десиканта. Действие препарата на организм сельскохозяйственных животных и человека глубоко не изучено. Между тем раундап является одним из наиболее широко рекламируемых в настоящее время гербицидов. Производство его и объем продаж увеличиваются, контроль же за содержанием остаточных количеств раундапа в продуктах животноводства не может быть обеспечен из-за отсутствия простого и чувствительного метода его определения, осуществимого в условиях областных и районных ветеринарных лабораторий, а также в лабораториях санитарно-эпидемиологического надзора.

Известен способ определения раундапа в воде, включающий экстракцию раундапа 0,5 М раствором бикарбоната аммония с использованием анионита, очистку экстрактов от коэкстрактивных веществ с помощью катионита, выпаривание, нанесение проб водой на пластинки целлюлозы, "Силуфол" и "Фиксион" с последующей разгонкой в разных системах подвижных растворителей, идентификацию реагентом, представляющим 0,5%-ный раствор нингидрина в этаноле с добавлением уксусной кислоты, и нагревание в термостате в течение 10 минут при температуре 110^oC. Диапазон определяемых концентраций 0,05 0,25 мг/л. Предел обнаружения 0,2 мкг. Процент определения составляет 85 90% (Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М. 1988. Ч. 17. С. 156 161).

Недостатками данного способа являются его трудоемкость и длительность, затрудняющие воспроизведение указанной чувствительности. При последовательном использовании анионитов и катионитов неизбежны существенные потери искомого вещества. Применение неорганического экстрагента (раствора бикарбоната аммония) увеличивает время выпаривания растворителя. Нанесение проб водой также удлиняет время анализа, так как вода долго испаряется из точки нанесения. Аналогичный эффект вызывает добавление воды в систему подвижных растворителей (для пластинок "Силуфол" используют систему из этилацетата и воды в соотношении 60 40), а проявлению нингидрином мешают естественные компоненты животных тканей (аминокислоты и пептиды), дающие цветную реакцию с нингидрином. Кроме того, требуется дополнительное нагревание пластинок в термостате.

Известен также способ определения раундапа в воде, почве, растительном материале, включающий замораживание сухим льдом, измельчение, экстракцию хлороформом с водой, центрифугирование, декантирование водного слоя, проводку через анионообменную смолу, промывку гидрокарбонатом аммония, выпаривание, проводку через колонку с катионитом, промывку водой, дополнительную очистку элюата активированным углем, нанесение проб на пластинки "Фиксион" с использованием в качестве подвижного растворителя для разгонки 0,05 М раствора натрия тетраборнокислого в воде с подогревом камеры до 50^oC с последующим проявлением пластинок реактивами сложного состава на основе нингидрина. (Методические указания по определению микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде. М. 1983. Ч. 13. С. 46 53).

Недостатками этого способа являются еще большая по сравнению с избранным прототипом трудоемкость, длительность анализа, большие потери вещества на колонках, что в значительной степени снижает чувствительность способа, а проявляющие реактивы на основе нингидрина не являются специфическими для соединений с C-P-связью, в том числе раундапа.

Ввиду высокого содержания аминокислот и их производных в биологических объектах указанные выше способы не могут быть использованы для определения раундапа в сыворотке крови, органах и тканях животных.

Цель изобретения повышение чувствительности и избирательности способа при упрощении и сокращении времени анализа.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве растворителя в процессе экстракции используют насыщенный гидроксидом натрия хлороформ, фильтруют, проводят выпаривание фильтрата, пробы наносят 50%-ным водным раствором ацетона на пластинки "Силуфол" и разгоняют в системе подвижных растворителей, состоящей из метанола, ацетона и ледяной уксусной кислоты в объемном соотношении 80 20 8, а для идентификации раундапа используют смесь равных объемов 2%-ного раствора нитрата серебра и 0,4%-ного раствора бромфенолового синего.

Использование в качестве экстрагента хлороформа связано с тем, что он быстро испаряется при выпаривании экстракта и хорошо экстрагирует раундап при насыщении гидроксидом натрия. После экстракции и фильтрации сразу проводят выпаривание без предварительной очистки. Очистка экстракта не требуется, так как холодный 50%-ный водный раствор ацетона, используемый для смывания проб, хорошо растворяет остатки раундапа и не смывает со дна выпаривательной чашки налет коэкстрактивных веществ. Потери искомого вещества при этом значительно меньше таковых при последовательном применении анионитов и катионитов.

В качестве подвижных растворителей для разгонки использовали смесь метанола, ацетона и ледяной уксусной кислоты, так как разгонка в такой камере идет в 3 раза быстрее, достигается близкая к оптимальной длина пробега (R_f 0,7) и достаточно хорошая концентрация пятна (в диапазоне от 0,2 до 10 мкг). Небольшая добавка уксусной кислоты к системе подвижных растворителей хорошо осветляет фон, вследствие чего не требуется дополнительная обработка пластинок раствором кислоты после опрыскивания бромфеноловым синим.

Проявляющий реактив (смесь равных объемов 2%-ного раствора нитрата серебра и 0,4%-ного раствора бромфенолового синего) выбран из числа используемых для обнаружения фосфорорганических соединений с тем, чтобы аминокислоты и пептиды не мешали определению раундапа.

Предлагаемый способ дает возможность осуществлять контроль за качеством продуктов животного происхождения при использовании в рационе животных подвергнутых десикации раундапом кормовых культур, а также при случайных острых отравлениях осуществлять прижизненную или посмертную диагностику токсикоза.

Способ обладает достаточно высокой чувствительностью и является селективным за счет точного подбора экстрагента, компонентов смеси подвижных растворителей и проявляющего реагента, прост в осуществлении, так как исключает многочисленные этапы очистки экстрактов с использованием ионообменных смол, обеспечивает более быстрое испарение и нанесение за счет замены экстрагента и раствора для смыва и нанесения проб, значительно сокращает время разгонки в результате замены компонентов системы подвижных растворителей.

Общие с прототипом признаки

1. Экстракция пестицида растворителем.

2. Выпаривание экстрагента.

3. Нанесение проб на пластинки.

4. Разгонка в системе подвижных растворителей.

5. Идентификация проявляющим реагентом.

Отличительные признаки предлагаемого способа%

1. Экстракцию пестицида осуществляют хлороформом, насыщенным гидроксидом натрия.

2. После экстракции сразу проводят испарение.

3. Нанесение проб на пластинки осуществляют 50%-ным водным раствором ацетона.

4. Разгонку проводят в системе подвижных растворителей, состоящей из метанола, ацетона и ледяной уксусной кислоты в объемном соотношении 80 20 8.

5. Для идентификации раундапа в качестве проявляющего реагента используют смесь равных объемов 2%-ного раствора нитрата серебра и 0,4%-ного раствора бромфенолового синего.

Способ осуществляют следующим образом.

Пример. Навеску мышечной ткани, печени, почек или легких по 5 г соответственно помещают в коническую колбу емкостью 200 см³, заливают 30 мл хлороформа, предварительно насыщенного гидрооксидом натрия, и экстрагируют на аппарате для встряхивания в течение 40 минут. Затем сливают через воронку, заполненную на 2/3 безводным сернокислым натрием, в выпаривательную чашку. К остатку снова добавляют 15 мл экстрагента, встряхивают 30 минут и сливают. Экстракцию повторяют трижды. Затем обезвоженный хлороформный экстракт испаряют досуха. Сухой остаток смывают 0,1 мл холодного 50%-ного водного раствора ацетона и наносят с помощью капилляра на пластинки "Силуфол". Пластинки помещают для разгонки в систему подвижных растворителей, состоящую из метанола, ацетона и ледяной уксусной кислоты в объемном соотношении 80 20 8.

После разгонки пластинку высушивают на воздухе, опрыскивают проявляющим реактивом, состоящим из равных объемов 2%-ного раствора нитрата серебра и 0,4% -ного раствора бромфенолового синего. При этом раундап обнаруживают в виде сине-фиолетовых пятен на желтом фоне пластинки. Количество препарата в пробе определяют путем сравнения интенсивности окраски и площади пятен пробы и стандартных растворов, используя следующую формулу:



где

X общее количество раундапа, мг/кг;

A количество раундапа в стандартном растворе, нанесенном на пластинку, мкг;

S₁ площадь пятна стандартного раствора раундапа, мм²;

S₂ площадь пятна раундапа из исследуемой пробы, мм²;

P масса исследуемой пробы, г.

При исследовании сыворотки крови и мочи (по 5 мл соответственно) экстракцию проводят в делительной воронке, а при расчете количества раундапа в пробе (в мг/л) вместо массы исследуемой пробы используют ее объем в мл.

Метрологическая характеристика способа представлена в таблице.