способ получения реактива для определения активированного парциального тромбопластинового времени

Формула изобретения

Способ получения реактива для определения активированного парциального тромбопластинового времени, включающий обработку отходов производства соевого лецитина растворителем, отделение раствора, высаждение из него продукта ацетоном, отделение осадка с высушиванием и последующие растворение в водном растворе защитного вещества и лиофилизацию, отличающийся тем, что непосредственно отходы производства соевого лецитина обрабатывают петролейным или диэтиловым эфиром при соотношении отходы растворитель 1 4 5, а в качестве защитного вещества используют сахарозу в виде 2%-ного водного раствора.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской промышленности, в частности, к способу получения реактива для определения активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ) из отходов производства соевого лецитина.

АПТВ дает общую информации о факторах, участвующих в процессе внутреннего пути свертывания крови, т.е. оно является ценным инструментом диагностики гемофилии. Необходимый для проведения теста АПТВ реактив - вещество фосфолипидной природы, обладающее прокоагулянтной активностью и реагирующее на дефект анализируемой плазмы.

Фосфолипидные агенты, используемые в изучении процессов коагуляции, в основном получают экстракцией органическими растворителями из высушенного ацетоном мозга человека или животного с последующими выделением и фракционированием [1].

Известен способ [2] получения реактива для определения АПТВ из тромбопластина, полученного водной экстракцией из мозговой ткани человека. Способ [2] включает 5-кратное отмывание сухого порошка тромбопластина ацетоном с последующим фильтрованием и высушиванием, экстракцию реактива из отмытого тромбопластина хлороформом в течение 2 ч, выпаривание экстракта и ресуспендирование сухого остатка в физиологическом растворе. Полученная суспензия употребляется как реактив для определения АПТВ.

Все способы получения реактива для определения АПТВ из мозга являются нетехнологичными из-за источника сырья. Кроме того, переработка трупного мозга опасна для персонала из-за возможности инфицирования.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к заявляемому способу является способ [3] получения реактива для определения АПТВ, согласно которому 1 часть отходов производства соевого лецитина растворяют в 8 частях хлороформа, добавляют 37-40 частей этанола, отбрасывают осадок, надосадочную жидкость выпаривают, сухой осадок растворяют в петролейном или диэтиловом эфире, осаждают целевой продукт ацетоном с последующим высушиванием, растворением в водном растворе защитного вещества и лиофилизацией. В качестве защитного вещества используют сорбит в виде 5%-ного водного раствора.

Способ [3] имеет то преимущество, что сырьем для получения реагента служат широко распространенные вещества, к тому же в виде отходов. Полученный реактив стабилен при температуре 4^oC в течение года. Однако способ [3] многостадиен, требует большого количества растворителей, которые необходимо очищать перегонкой, а, кроме того, выход продукта не превышает 22-27% от теоретически возможного. Все это приводит к высоким производственным расходам, делающим выпуск реактива для определения АПТВ низкорентабальным, а цену на реактив высокой.

Целью изобретения является упрощение технологии, снижение затрат и увеличение выхода реактива для определения АПТВ.

Было обнаружено, что при обработке отходов производства соевого лецитина петролейным или диэтиловым эфиром последние растворяют только те вещества, которые необходимы для определения АПТВ. Это позволило исключить ряд операций и повысить выход целевого продукта.

Цель изобретения достигается тем, что в способе получения реактива для определения АПТВ, включающем обработку отходов производства соевого лецитина растворителем, отделение раствора, высаждение из него продукта ацетоном, отделение осадка с высушиванием его и последующие растворение в водном растворе защитного вещества и лиофилизацию, непосредственно отходы производства соевого лецитина обрабатывают петролейным или диэтиловым эфиром при соотношении отходы: эфир = 1:(4-5), а в качестве защитного вещества используют сахарозу в виде 2%-ного водного раствора.

Отходы производства соевого лецитина представляют собой фосфолипиды сои, не растворившиеся в этаноле при получении соевого лецитина способом, описанным в [4]. Кроме отходов производства соевого лецитина в заявляемом способе используют петролейный эфир (ТУ МХП 1867-48), диэтиловый эфир медицинский, ацетон (ГОСТ 2603-71), сахарозу (ГОСТ 5833-75) и дистиллированную воду.

Пример 1. 20 г фосфолипидов сои, не растворившихся в этаноле в процессе экстракции соевого лецитина из обезжиренных фосфатидов, высушенных на воздухе и хранившихся при 4^oC в течение до полугода, растворяют в 100 мл петролейного эфира (соотношение 1:5). Нерастворившийся осадок удаляют центрифугированием. Эфирный раствор при перемешивании вливают в 500 мл ацетона. Выпавший осадок центрифугируют и высушивают в вакууме. Получают 18,9 г конечного продукта, что составляет 94,5% от исходного.

Характеристики полученного фосфолипида: содержание фосфора 2,7%, кислотное число 55,3 мг КОН.

Для получения АПТВ-реактива фосфолипиды растворяют в 2%-ном растворе сахарозы (pH 7,4). Точную концентрацию фосфолипида, лежащую в границах 0,1-0,2%, подбирают опытным путем на основании данных специфической активности. Раствор разливают в пенициллиновые флаконы по 2 мл, замораживают при -60^oC и подвергают сублимационной сушке. Температура препарата в конечном периоде сушки не превышает 20^oC. Общая продолжительность сушки 36 ч.

Пример 2. 100 г фосфолипидов сои, не растворившихся в этаноле в процессе экстракции соевого лецитина из обезжиренных фосфатидов и высушенных на воздухе, перемешивают с 400 мл диэтилового эфира до полного растворения (соотношение 1: 4). Затем эфирный раствор тонкой струйкой при перемешивании на мешалке вливают в 2000 мл ацетона. Выпавший осадок центрифугируют, промывают 200 мл охлажденного ацетона и вновь центрифугируют. Осадок сушат под струей азота. Всего получают 87,5 г конечного продукта. Выход 87,5%.

Характеристики полученного фосфолипида: содержание фосфора 2,9%, кислотное число 50,6 мг КОН.

Реактив для определения АПТВ получают так же, как в примере 1.

Уменьшение концентрации раствора сахарозы ведет к ухудшению внешнего вида высушенного реактива (наблюдается образование рыхлого материала, склонного рассыпаться при перемещении, встряхивании флаконов с реактивом), уменьшению стабильности при хранении и снижению специфической активности. Увеличение концентрации не повышает качество лиофилизированного реактива, а лишь увеличивает расход сахарозы.

Использование в качестве защитного вещества сахарозы, а не сорбита делает реактив более дешевым, так как стоимость сахарозы значительно ниже стоимости сорбита. Кроме того, применение сорбита требует перед лиофилизацией выдержки в течение 15 дней, раствор с сахарозой можно сушить уже через сутки после замораживания.

Лиофилизированный реактив восстанавливают добавлением хорошо перемешанной суспензии каолина (5 мг на 1 мл дистиллированной воды). Каолин предварительно должен быть очищен от механических примесей и крупных частиц, попадание которых в систему для определения АПТВ увеличивает значение АПТВ плазмы здоровых лиц и снижает точность определения.

Восстановленный реактив стабилен при 4^oC в течение 20 дней, а при комнатной температуре в течение недели. Столь высокая стабильность восстановленной формы существенно отличает предлагаемый реактив от аналогов, получаемых из биологического сырья, которые теряют свою активность на следующий день после восстановления. Стабильность восстановленной формы создает условия для более экономного использования реактива клиническими лабораториями и в конечном итоге делает его более дешевым.

Полученный предлагаемым способом АПТВ реактив оценивался на основании определения АПТВ доноров и больных гемофилией.

Кровь отбирали венопункцией и стабилизировали 3,8%-ным раствором основного цитрата натрия (9 ч. крови и 1 ч. стабилизатора). После перемешивания и центрифугирования в течение 10 мин при 4000 об/мин пипеткой отбирали плазму, которую использовали в течение 2 ч после взятия крови.

В нагретые до 37^oC центрифужные пробирки помещали 0,1 мл тщательно перемешанного АПТВ реактива, инкубировали при 37^oC в течение 3 мин. Затем добавляли 0,1 мл исследуемой плазмы и инкубировали в течение 2 мин с периодическим встряхиванием. По истечении срока инкубации добавляли 0,1 мл подогретого до 37^oC 0,025 М раствора хлорида кальция и одновременно включали секундомер, начиная измерение времени свертывания. Определение повторяли 2 раза и брали среднее арифметическое.

Определение АПТВ одних и тех же образцов плазмы доноров и больных гемофилией проводили с использованием АПТВ реактивов, полученных по предлагаемому способу и по прототипу. При обследовании больных гемофилией вычисляли индекс АПТВ - отношение АПТВ больного к АПТВ контроля (смесь свежих плазм не менее 5 доноров или лиофилизированный стандарт донорской плазмы). Сравнение чувствительности двух реактивов проводили сопоставлением индексов АПТВ, определенных разными реактивами для одного к того же больного, исследована выборка из 12 больных гемофилией А.

В табл.1 представлены значения АПТВ одних и тех же образцов плазмы здоровых лиц, определенных реактивами, полученными по прототипу и по предлагаемому способу. Очевидно, что реактивы, полученные по предлагаемому способу, обладают такой же прокоагулянтной активностью (серия 60), что и реактив, полученный по прототипу (серия 57), либо более высокой (серия 58).

В табл. 2 даны результаты сравнительного исследования чувствительности реактивов к выведению гемофилии А. Реактивы, полученные по предлагаемому способу, более чувствительны к выявлению заболевания по сравнению с прототипом (различие статистически достоверно).

Специфические свойства лиофильно высушенного реактива, полученного по предлагаемому способу, практически не изменяются при хранении при 4^oC в течение года (табл.3).

Источники информации

1. a). Bell W.W., Alton H.C.// Nature. - 1954.- v.174.- p.880-881.

b) Poller L. , Thomson J.M.// J.Clin.Pathol. - 1972.- v.25,N 10.- p. 1038-1044.

c) Soloway H.B., Cornett B.M., Grayson J.W.// Am.J.Clin.Pathol. 1973.- v.59, N 5.- p.587-590.

d) Stevenson K. J. , Easton A.C., Curry A., Thomson J.M., Poller L.// Thromb. Haem.- 1986.- v.55, N 2.- p.250-258.

2. Папаян Л.П., Хролова П.В. // Лабораторное дело.- 1980.- N 11, с.665.

3. Патент РФ N 1767743, кл. A 61 K 37/22, приор. 02.07.90, 1994 - прототип.

4. Патент РФ N 1231658, кл. A 61 K 35/78, приор. 13.01.84, 1994.