препарат с иммуномодулирующими свойствами

Формула изобретения

1. Препарат с иммуномодулирующими свойствами на основе цитокинов, отличающийся тем, что он содержит гибридный белок альфа-1-тимозин фактор некроза опухолей альфа-тимозин-альфа-1, выделенный из микроорганизма, в который введена рекомбинантная плазмида pThy 325, кодирующая синтез белка, стабилизирующие добавки и солевую буферную систему при следующем соотношении компонентов, мас.

Гибридный белок 0,0008 0,0015

Стабилизирующие добавки 10 20

Солевая буферная система pН 7,0 7,2 1,03 1,06

Вода Остальное

2. Препарат по п. 1, отличающийся тем, что в качестве стабилизирующих добавок используют полиглюкин, желатиноль, сахарозу.

3. Препарат по п.1, отличающийся тем, что в качестве солевой буферной системы используют забуференный физиологический раствор хлорида натрия.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии, а именно к получению лиофилизированных лекарственных форм, обладающих иммуномодулирующей активностью, и может быть использовано для неспецифической профилактики и лечения инфекционных заболеваний.

Известен препарат на основе тимозина ₁-пептидного гормона вилочковой железы [1]. В организме животных N-концевой аминокислотный остаток тимозина ацетилирован. Дезацетилтимозин сохраняет биологическую активность, присущую ₁-тимозину [2] . Тимозин ₁ играет одну из ключевых ролей в становлении и развитии иммунного ответа, обусловливая созревание, дифференцировку и функционирование Т-лимфоцитов, индуцируя появление Т-клеточных поверхностных антигенов, выработку лимфокинов, усиливая противоопухолевый, противоинфекционный иммунитет и эффективность вакцинации, способствуя развитию адекватного вакцинного процесса [3 - 5]. Основным недостатком тимозина фракции [5], выделяемой из гомогенатов тимуса животных, является содержание в готовом препарате большого числа балластных полипептидов, не обладающих полезной биологической активностью, но увеличивающих иммунную нагрузку на организм [5]. Рекомбинантный дезацетилтимозин , получаемый генноинженерными методами из E. coli, является дорогостоящим продуктом, требующим сложных методов выделения и очистки, таких как жидкостная хроматография высокого давления.

Известен также препарат на основе фактора некроза опухолей ₁ (ФНО), обладающий широким спектром биологической активности, однако имеющий существенный недостаток при использовании в качестве терапевтического средства - побочные токсические эффекты [6]. Это обстоятельство ограничивает клиническое применение ФНО.

Сконструирована плазмида pThy325, кодирующая субстанцию гибридного белка на основе ₁-тимозина и ФНО (Т-ФНО-Т) [7]. Однако не отработана технология получения полупромышленных количеств хроматографически чистого белка из биомассы микроорганизмов, получение лекарственной формы препарата на основе Т-ФНО-Т, не определены условия, обеспечивающие стабильность белка в составе готовой лекарственной формы, и эффективность его иммунобиологических свойств на животных.

Задача изобретения - разработка лекарственной формы высокоочищенного иммунобиологически активного препарата на основе гибридного белка Т-ФНО-Т, не имеющего побочных токсических эффектов.

Поставленная задача решается тем, что предложен препарат с иммуномодулирующими свойствами, содержащий гибридный белок Т-ФНО-Т, выделенный из микроорганизма, в который введена рекомбинантная плазмида pThy 325, кодирующая синтез белка, стабилизирующие добавки и солевую буферную систему при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Гибридный белок - 0,0008 - 0,0015

Стабилизирующие добавки - 10 - 20

Солевая буферная система pH 7,0 - 7,2 - 1,03-1,06

Вода - Остальное

В качестве стабилизирующих добавок используют полиглюкин, желатиноль, сахарозу, а в качестве солевой буферной системы - физиологический раствор хлорида натрия.

Предложенный препарат получил название НЕОТИМ NC.

Пример 1. Способ получения белка Т-ФНО-Т и препарата на его основе. Для получения гибридного белка Т-ФНО-Т используют культуру Escherichia coli, несущую рекомбинантную плазмидную ДНК pThy 325, кодирующую синтез белка -₁-тимозин - фактор некроза опухолей ₁-тимозин.

Штамм E.coli SG20050 трансформируют плазмидной pThy 325 следующим образом. Культуру E.coli SG20050, полученную после хранения на косяках в полужидком агаре под вазелиновым маслом, засевают в 5 мл LB-больона, содержащего 0,5% триптона, 1% дрожжевого экстракта, 1% NaCl при pH 7,2 и температуре 37^oC. Полученной культурой засевают колбы с LB-бульоном объемом 250 - 500 мл и термостатируют на качалке при температуре 37^oC до оптической плотности суспензии 0,3 при длине волны 590 нм по фотоэлектроколориметру. Из полученной суспензии отбирают 100 мл культуры и центрифугируют при 300 g и температуре 4^oC в течение 10 мин. Клеточный осадок суспендируют в 50 мл 0,1 М раствора CaCl₂, охлажденного до 0^oC. Приготовленные таким образом компетентные клетки в количестве 0,2 мл смешивают 2 мгк плазмидной ДНК pThy325 и инкубируют при температуре 0^oC в течение 1 ч, затем 5 мин при температуре 42^oC. Трансформированную культуру вносят в 100 мл нагретого до температуры 37^oC LB-бульона и инкубируют при указанной температуре 1,0 - 1,5 ч. Приготовленной посевной культурой свежеполученного трансформанта в количестве 100 мл засевают ферментер вместимостью 10 л в объем среды (LB-бульон с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл) 7 л и культивируют при температуре 37^oC, частоте перемешивания 250 - 300 мин^-1 и аэрировании среды с расходом воздуха 0,5 л/мин на 1 л среды до выхода культуры на стационарную фазу роста. По окончании культивирования берут пробу суспензии для определения уровня синтеза гибридного белка методом электрофореза в 15% полиакриламидном геле в системе диск-фореза (ДСН-ПААГ).

Полученную трансформированную культуру осаждают центрифугированием (можно использовать сепарирование, микрофильтрацию) и полученный концентрат суспендируют в лизирующем буфере следующего состава: 20 мМ трис-HCl pH 7,5; 5 мМ Na-ЭДТА и 1 мМ феноксиметилсульфонилфторида из расчета 1 г сырой клеточной биомассы в 10 мл буфера. Клетки в лизирующем буфере разрушают также одним из принятых методов, например, замораживанием до температуры -70^oC и оттаиванием до температуры 4^oC. Лизат центрифугируют в течение 10 мин при температуре 4^oC и 5000 g, затем надосадочную жидкость сливают, а осадок повторно ресуспендируют в лизирующем буфере в указанном выше соотношении - 1 г осадка на 10 мл буфера - и повторяют центрифугирование по приведенному ранее режиму. Супернатант сливают, осадок ресуспендируют при соотношении 1 : 10 в 6 М растворе мочевины и еще раз центрифугируют. Полученная таким образом надосадочная жидкость представляет собой раствор гибридного белка Т-ФНО-Т 60 - 70%-ной электрофоретической чистоты.

Характеристика белка:

1 Met Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys

16 Asp Leu Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asp Pro

31 Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val

46 Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg

61 Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln

76 Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val

91 Leu Phe Val Gly Gln Glu Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr

106 His Thr Lys Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn

121 Leu Leu Ile Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu

136 Gly Ala Ser Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly

151 Val Phe Glu Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn

166 Arg Pro Gln Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe

181 Gly Ile Asp Ala Leu Ile Fsp Met Ser Asp Ala Ala Val Asn Thr

196 Ser Ser Ile Ile Thr Thr Lys Asp Leu Lys Glu Lus Lys Glu Val

211 Val Glu Glu Ala Glu Asn

Количество аминокислотных остатков 216. Молекулярный вес 23783D. Изоэлектрическая точка 4,46.

Способ хроматографической очистки белка является предметом "ноу-хау".

Хроматографически чистый белок, диализованный против солевой буферной системы с pH 7,0 - 7,2 с десятикратным количеством буфера против раствора белка с содержанием целевого белка не менее 95% от общего белка и с концентрацией не менее 30010 мкг/мл смешивают с раствором стабилизатора и солевой буферной системы в соотношении, обеспечивающем расчетное содержание белка 111 мкг/мл или 1052 мкг/мл при следующем соотношении веществ в растворе, мас.%:

Гибридный белок - 0,001

Полиглюкин - 15

Забуференный физиологический раствор (ЗФР) - 1,03

Вода - Остальное

Рабочий раствор белка с концентрацией 10 мкг/мл или 100 мкг/мл в стабилизирующей солевой системе разливают в ампулы или пенициллиновые флаконы соответственно по 1 мл, замораживают и лиофилизируют до остаточной влажности не выше 5%, после чего флаконы закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками, а ампулы запаивают по общепринятой технологии.

Пример 2. Способ получения белка Т-ФНО-Т и препарата на его основе. Для получения гибридного белка Т-ФНО-Т используют культуру Salmonella dublin S. 6, несущую рекомбинантную плазмиду ДНК pTh325, кодирующую синтез белка -₁-тимозин - фактор некроза опухолей ₁-тимозин.

Остальное приготовление препарата выполняется в соответствии с примером 1 при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Гибридный белок - 0,0008

Желатиноль - 10

ЗФР - 1,06

Вода - Остальное

По указанной схеме можно получать гибридный белок и препарат на его основе, используя любой микроорганизм, в котором экспрессируется рекомбинантная ДНК, кодирующая синтез белка -₁-тимозин - фактор некроза опухолей ₁-тимозин.

Пример 3. Проверка стабильности и активности препарата при хранении в лиофилизированном состоянии. В качестве контроля взят 15%-ный полиглюкин. Образцы препаратов 1-3 и контроля готовят и высушивают как в примере 1. Стабильность препаратов и активность иммунобиологической субстанции оценивают до и после хранения при температуре 42^oC и при 252^oC в течение 18 - 24 мес. После регидратации препарата в 1,0 мл воды для инъекций измеряют стабильность гибридного белка электрофоретическим методом в системе 15%-ной ПААГ-ДСН, определяя долю сохранившегося нативного мономера с молекулярной массой 24 кД по отношению к исходному количеству белка. Активность препарата определяют по индексу стимуляции антителопродукции. Для анализа интенсивности антителопродукции на тимусзависимые антигены мышей внутрибрюшинно иммунизируют эритроцитами барана в дозе 510⁷ клеток и одновременно вводят исследуемый препарат в дозах 310^-7 М. После иммунизации определяют количество антителообразующих клеток (АОК) среди 10⁶ клеток селезенки с помощью теста гемолиза эритроцитов. Результаты представляют в виде индекса стимуляции как отношение количества АОК в опыте к контрольному (контроль - АОК мыши, которой не вводился препарат). Индекс стимуляции должен составлять около 2.

Полученные данные приведены в табл. 1, где прослежено влияние стабилизирующих веществ на стабильность и активность гибридного белка Т-ФНО-Т при хранении в лиофилизированном состоянии

Из табл. 1 следует, что максимальная стабилизация белка в составе препарата обеспечивается при использовании полиглюкина и желатиноля, позволяя сохранить активность белка на исходном уровне в течение двух лет при температуре хранения 42^oC. При температуре 252^oC препарат может храниться не более 1- 2 мес., что дает возможность транспортировки препарата при обычных условиях в указанные сроки без потери активности.

Пример 4. Проверка стабильности и активности препарата при хранении в регидратированном состоянии. Предлагаемый препарат готовят, как в примере 1, с концентрацией гибридного белка перед сушкой 10 мкг/мл и после лиофилизации рабочего раствора, разлитого по 1 мл, препарат регидратируют соответственно в 1,0 мл (образец 1) и 10 мл (образец 2) воды для инъекций, а затем проверяют сохранение активности гибридного белка Т-ФНО-Т в процессе хранения при температуре 42 и 202^oC в течение 20 суток (табл.2) в полученных растворах с физиологической концентрацией солей.

Из представленных данных в табл. 2 следует, что предложенный комплекс веществ, входящий в состав препарата, обеспечивает сохранение исходных свойств белка Т-ФНО-Т в регидратированном состоянии в течение 10 суток при температуре 42^oC.

Пример 5. Влияние препарата НЕОТИМ NC на развитие гуморального иммунитета при вакцинации против бактериальных инфекций. Установлено, что становление и развитие противоинфекционного иммунитета к заболеванию, вызываемому Yersinia pestis, в организме животного связано прежде всего с выработкой специфических иммуноглобулинов класса M (IgM) [8]. Влияние препарата на эффективность вакцинации проверяют с использованием беспородных белых мышей массой 18 - 20 г и морских свинок массой 250 - 300 г. Препарат после регидратации в воде для инъекций вводят в дозе 10 мкг на одно животное подкожно в одну заднюю лапу, а вакцину - в другую. Вакцинацию проводят живым штаммом Y. pestis EV76 в дозе (1,0 - 2,0)10⁵ микробных клеток. Последующее заражение проводят вирулентным штаммом Y.pestis 231 в дозах от 10² до 10⁵ микробных клеток в группах по шести животных на дозу. Морских свинок заражают подкожно и интратрахеально (табл. 3), а белых мышей - внутрибрюшинно (табл. 4). Наблюдения ведут в течение 21 суток, определяют величину LD₅₀ и среднюю продолжительность жизни павших животных (Т_ж).

Результаты вакцинации (табл. 3 и 4) сравнивают с аналогичными данными, полученными при использовании в качестве адъюванта тимозин и вакцинации без адъюванта (контроль).

Сравнение результатов, полученных на белых мышах и морских свинках, показывают, что использование препарата гибридного белка Т-ФНО-Т в качестве адъюванта при вакцинации против чумы обеспечивает снижение LD₅₀ в 50 - 100 раз по сравнению с контролем и сохранение этих показателей примерно на том же уровне по сравнению с применением в качестве адъюванта тимозина ₁.

В табл. 5 представлены данные по влиянию разовых доз (0,8; 4,0 и 20,0 мкг) препарата НЕОТИМ NC, вводимого морским свинкам при экспериментальном интратрахеальном заражении вакцинированных животных вирулентным штаммом Y. pestis на устойчивость животных к инфекции.

Полученные данные показывают, что максимальный эффект достоверного увеличения LD₅₀ и Т_ж соблюдается при однократном введении 4 - 20 мкг препарата в расчете по действующему веществу (Т-ФНО-Т).

Пример 6. Применение препарата в качестве адъюванта при вакцинации птицы против вирусных инфекций. Известно, что становление и развитие адекватного напряженного иммунного процесса при вирусных инфекциях связано с кооперативным функционированием как клеточного, так и гуморального звеньев иммунитета при активном участии в нем макрофагов [9].

Препарат НЕОТИМ NC используют в качестве адъюванта при интраназальной вакцинации молодняка кур-несушек в возрасте 45 суток в количестве 50000 голов против инфекционного ларинготрахеита и ньюкастлской болезни птиц совместно с вакцинами из штаммов "ВНИИБП" и "Бор-74 ВГНКИ" соответственно. Доза препарата в расчете на одну голову 2,0 - 2,5 мкг по гибридному белку Т-ФНО-Т. Эффективность вакцинации оценивают путем определения титра специфических антител в крови птицы по реакции торможения гемагглютинации (РТГА) в опытной и контрольной (без применения НЕОТИМА NC) и по сохраняемости поголовья.

Показатели эффективности вакцинации молодняка кур несушек с применением и без применения НЕОТИМА NC приведены в табл. 6.

Анализ полученных данных позволяет сделать вывод, что использование в качестве адъюванта препарата НЕОТИМ NC привело к 100%-ной отвечаемости опытного стада на вакцинацию, при этом 80% из них имели средний титр 1/8 - 1/32, в то время как в контрольном стаде наблюдались как полная неотвечаемость на вакцинацию, так и разброс по титрам антител, что свидетельствует о иммуномодулирующих свойствах предлагаемого белка. Показатели выживаемости птицы также свидетельствуют о целесообразности использования иммуномодулятора при вакцинации, так как в опытном стаде она составила на 98-е сутки жизни птицы 86,5%, в то время как в опытной на 73-и сутки этот показатель составил 83,1%.

Пример 7. Применение препарата НЕОТИМ NC в качестве адъюванта при вакцинации собак против вирусных инфекций. Препарат получают как в примере 1. Оценивается эффективность вакцинации собак против чумы плотоядных, парвовирусного энтерита и аденовирусных инфекций при применении в дозах 10 мкг Т-ФНО-Т при первичной вакцинации и 20 мкг - при вторичной независимо от веса прививаемого животного (для собак весом до 5 кг доза препарата уменьшается в два раза). При вакцинациях применялись вакцины отечественного производства, выпускаемые без адъювантов: вакцина из штамма ЭПМ против чумы собак сухая; вакцина против аденовирусных инфекций и парвовирусного энтерита собак (Триовак), Мультикан II и Мультикан IV. Проведена вакцинация 63 собак различных пород: шнауцеры, овчарки, ротвейлеры, пудели, доберманы-пинчеры, боксеры, пекинесы и т.д. по схемам и в сроки, рекомендуемые в наставлении по применению вакцин. В качестве контроля использовали данные по вакцинации собак указанными вакцинами без применения препарата. Всего было привито 102 животных. Из общего числа животных, прививаемых с адъювантом, у 10 - 15 на вторые или третьи сутки отмечалось незначительное снижение аппетита, которое восстанавливалось на следующие сутки. Других побочных действий отмечено не было. Подобная реакция на вакцинацию отмечалась и у животных, вакцинированных без применения НЕОТИМА NC. В течение срока наблюдения за привитыми животными (1 год) случаев заболевания инфекциями, против которых делались прививки, не отмечалось. Все собаки развивались без отклонений от нормы, отличались хорошим аппетитом и нормальным половым созреванием.

Среди собак, привитых без применения НЕОТИМА NC, было зарегистрировано 5 случаев заболевания чумой, 7 случаев заболевания вирусным энтеритом и 3 случая заболевания аденовирусной инфекцией, протекающей по типу инфекционного гепатита. Данные получены в Новгородском совхозе-техникуме, о чем составлен акт испытаний.

Пример 8. Применение препарата НЕОТИМ NC в качестве терапевтического средства при лечении вирусных заболеваний собак. Препарат получают как в примере 1. Оценивается эффективность препарата при лечении вирусных заболеваний собак: чумы плотоядных, парвовирусного энтерита, инфекционного гепатита, аденовирусной инфекции верхних дыхательных путей. Препарат используется в дозах 10 мкг на 10 кг массы животного, но не более 100 мкг на один прием. Вводится внутримышечно или перорально в растворе по пункту 2.

1. Чума плотоядных. Пролечено 53 собаки различных пород. Диагноз ставился на основании клинических признаков и серологических данных с использованием метода ИФА со специфическим антигенами (Санкт-Петербург, биоцентр Чин). При лечении начальной формы заболевания на 1 - 3 сутки проявления клинических признаков НЕОТИМ NC применяли совместно с препаратами традиционной терапии по следующей схеме: в течение 3 дней по 1 инъекции в дозе 10 мкг в 1 мл на животное весом более 5 кг и 0,5 мл этого раствора при меньшем весе собаки. Одновременно препарат дается перорально в указанной дозировке в течение 7 - 14 дней. Из 24 животных все выжили без признаков каких-либо осложнений. При лечении в поздние сроки обращения на фоне развившейся легочной и нервной форм схема лечения оставалась аналогичной, однако курс инъекций повторяли через 3 дня. Из 29 собак 10 погибли, так как животные были в терминальном состоянии и на момент начала лечения развилась острая легочная и сердечная недостаточность. Остальные 19 животных выздоровели без признаков осложнений (тики, парезы).

2. Инфекционный гепатит. Схема лечения как при чуме плотоядных. Пролечено 14 собак, эффективность лечения составила 100%. Особенно отмечено благотворное влияние препарата на восстановление функций печени. Все собаки выздоровели без необходимости соблюдения профилактической диеты.

3. Аденовирусные инфекции с поражением подчелюстных лимфоузлов и верхних дыхательных путей. Лечение по схеме начальной стадии чумы, особо указано на нецелесообразность применения препарата более 3 сут. Эффективность лечения составила 100%, всего было пролечено 70 собак.

4. Энтериты вирусной природы. При лечении этой группы заболеваний показана наибольшая эффективность препарата с выраженным действием уже через 5 - 6 ч после применения. При этом отмечается прекращение рвоты и диарейного синдрома, даже в случае кровавого профузного поноса. Препарат применяют по схеме лечения чумы в начальной стадии заболевания в сочетании с препаратами, восстанавливающими водно-солевой баланс. При лечении энтеритов вирусной природы особое внимание необходимо уделять восстановлению нормального функционирования сердечно-сосудистой системы, так как препарат может приводить к ее повышению. Всего было пролечено 70 собак, из которых 12 погибло, так как на момент лечения они находились в коматозном терминальной состоянии.

Таким образом, разработан новый иммунологический препарат НЕОТИМ NC, содержащий в качестве действующего начала рекомбинантный гибридный полипептид, состоящий из фактора некроза опухолей ₁ и тимозина- -₁ в следующем сочетании компонентов: ₁ -тимозин - фактор некроза опухолей ₁ -тимозин. Препарат обладает выраженным действием на B- и T-звенья иммунной системы, стимулируя развитие адекватного напряженного иммунного ответа при вакцинации от бактериальных вирусных инфекций и повышая неспецифическую резистентность организма при применении для лечения вирусных заболеваний. Препарат не имеет побочных токсических эффектов.

Источники информации

1. Яковлев Г. М. , Новиков В.С., Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. Механизмы биорегуляции. - СПб.: Наука, 1992, 40 с.(Биорегуляция).

2. Bistoni F., Baccarini M., Blasi E., at al. Thymus, 1985, v.7, N 2, р. 69 - 84.

3. Goldstein A.L., Low T.L.K. Prog. Immunolog, v. 5, р. 1417 - 1427.

4. Low T. L.K., Goldatein A.L. Thymic Hornones Limphokines. Bas. Chem. Clin. Appl. Ed A. Goldstein.-plenum Press.: New York, 1988, р. 21 - 35.

5. Арион В.Я., Санита И.В., Бреус Ю.П. и др. Химия и биология иммунорегуляторов. - Рига: Зинатне, 1985, с. 39 - 52

6. Beutler B. , Cerami A. Biochemistry, 1988, v. 27, N 20, р. 7575 - 7582.

7. Шмелев В.А. и др. Вестник Российской Академии Медицинских наук. 1994, N 6, с. 55 - 61.

8. Клеточная иммунология и аллергология. - М.: Медицина, 1986, 446с.

9. Косякова П.Н., Ровнова З.И. Противовирусный иммунитет. - М.: Медицина, 1972, 295 с.