способ определения резистентности биоматериала ксеноклапанов сердца к кальцификации

Формула изобретения

Способ определения резистентности биоматериала ксеноклапанов сердца к кальцификации, заключающийся в оценке способности биоматериала связывать ионы кальция, отличающийся тем, что проводится определение количества доступных титрованию щелочью специфических ионизируемых групп боковых цепей макромолекул биополимеров испытуемого биоматериала, который при их количестве, не превышающем 0,6 10¹⁷ на 1 см² считается резистентным к кальцификации.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для экспресс-оценки новых методов обработки ксеноклапанов сердца к кальцификации, что имеет важное практическое значение для обеспечения прочностных свойств применяемых в них консервированных биологических тканей.

В настоящее время для оценки резистентности биоматериала ксеноклапанов сердца к кальцификации наряду с подкожной имплантацией лоскутов ксеноматериала грызунам применяются модели кальцификации in vitro.

Прототипом заявляемого является метод, описанный (Nimni M.E. Cheung D. Strates B. et al. Chemically modified collagen: a natural biomaterial for tissue replacement. J. Biomed. Mater.Res. 1987, vol. 21, p. 741-771). Суть метода состоит в помещении испытуемого материала в метастабильный раствор фосфата кальция с последующим определением кальция в среде инкубации или в образце.

Приведенный способ имеет существенный недостаток: о степени резистентности биоматериала к кальцификации судят либо по убыли кальция из раствора, что сопряжено с неизбежной погрешностью в силу спонтанного выпадения в осадок нерастворимого продукта реакции, либо по определению количества кальция, преципитированного на образце, что точнее, но требует большого числа определений. Кроме того, от момента постановки эксперимента до получения статистически достоверного заключения в отношении того или иного метода обработки биоматериала проходит весьма много времени (около трех суток). Это связано с подготовкой образца к химическому определению кальция (высушивание до постоянного веса, сжигание, растворение в кислоте). Во время этих операций происходит неизбежная потеря кальция, что может привести к искажению результата. Более того, указанные недостатки приводят к незначительной задержке внедрения новых типов ксеноклапанов сердца к клиническую практику.

Целью изобретения является повышение точности оценки резистентности к кальцификации используемого в биоклапанах ксеноматериала с сокращением времени проведения исследования.

Указанная цель достигается тем, что вместо химических методов определения кальция использован метод кислотно-основного титрования (КОТ). При этом образец испытуемого биоматериала титровали щелочью для определения количества ионизируемых групп, способных акцентировать ионы кальция. Методика КОТ широко применяется в молекулярной биологии и описана в литературе (Калоус В. Павличек З. Биофизическая химия. М. Мир, 1985. с. 183-185). Сущность способа состоит в определении количества доступных титрованию боковых карбоксильных групп аспартата, глутамата и сульфгидрильных групп цистеина исследуемого лоскута ксеноматериала. Участие этих групп в связывании ионов кальция достаточно точно установлено (Левицкий Д.О. Кальций и биологические мембраны. М. Высшая школа, 1990, с. 124; Ленинджер А. Биохимия. М. Мир, 1976, с. 957). Результат выражают в количестве ионизируемых групп на квадратный сантиметр поверхности образца. Если суммарное число групп указанных типов не превышает 0,610¹⁷/см², то ксеноматериал считается резистентным к кальцификации. Определение количества ионизируемых групп проводили описываемым ниже образом.

Исследуемый образец 20х20 мм (больше не желательно, так как контакт лоскута с электродами в электродной ячейке pH-метра приводит к помехам на выходе прибора) помещают в 20 мл (с учетом емкости электродной ячейки) 0,15 М раствора NaCl, подкисленного до pH 2 0,25М HCl (при этом pH все ионизируемые группы находятся в протонированной форме). Титруют раствор с лоскутом 0,3М NaOH от pH 2 до 11 (все ионизируемые группы депротонированы) с одновременной регистрацией кривой титрования самописцем при постоянной скорости движения ленты 30 мл/мин и подачи титранта 0,3 мл/мин в электродную ячейку. Количество титруемых карбоксильных и сульфгидрильных групп лоскута ксеноматериала рассчитывали по значениям буферной емкости в соответствующих pKa: 4,5 и 8,7. Значения буферной емкости рассчитывались из разницы в количестве щелочи (мкмоль) в указанных pKa по результатам титрования раствора с лоскутом и раствора без лоскута. При этом кривые титрования холостой пробы (не менее четырех для возможности обработки результатов по Стъюденту) должны полностью совпадать. Расчет числа доступных титрованию ионизируемых групп проводили по формуле:

n A₂-A₁/K

где n число ионизируемых групп;

A₂ и A₁ количество NaOH (мкмоль), пошедшее на титрование раствора с лоскутом ксеноматериала (A₂) и без лоскута (A₁) в данной точке pKa;

K коэффициент пересчета, определяемый индивидуально для каждой регистрирующей системы.

Определение коэффициента K проводили по результатам титрования L-цистеина. Для этого 20 мл 0,15 М раствора NaCl, содержащего 10^-4 М L-цистеина титровали от pH 2 до 11. Так как для титрования использовали 0,3М NaOH, то с учетом коэффициента активности, равного 0,715, получаем: 0,30,715=0,215 М/л. Тогда на 1 мм записи приходится 2,15 мкмоль щелочи. На титрование калибрующего раствора было израсходовано: 90 мм x2,15=190 мкмоль щелочи. Так как 10^-4 М цистеина содержат 1,810²⁰ ионизированных групп, то на одну группу приходится: 190:1,810²⁰=1,110^-18 мкмоль щелочи или одна молекула на один отщепляемый протон. Эта величина является численным значением коэффициента пересчета применяемой нами регистрирующей системы.

Приводим конкретный пример расчета количества титруемых карбоксильных групп образца перикарда 1 ( см. таблицу ). Разность в количестве NaOH (A) в pKa 4,5 составляет 1,07 мкмоль щелочи. Эта буферная емкость определяется карбоксильными группами лоскута с площадью поверхности 220+220=80 мм²= 8,0см². С учетом этого на 1 см² приходится: 1,1:8,0 мкмоль щелочи / на 1см² поверхности: 1,110^-18=1,410¹⁷ депротонированных карбоксильных групп /1 см² поверхности испытуемого образца ксеноматериала.

Проверка данного метода показала полное соответствие количества титруемых ионизируемых групп образца с его способностью к преципитированию кальция. В таблице приведены результаты оценки резистентности к кальцификации ксеноперикарда двух разных типов обработки, полученные с помощью способа-прототипа и предлагаемого.

Приведенный пример показывает, что четырехкратное уменьшение количества титруемых карбоксильных и сульфгидрильных групп в образцах перикарда второго типа обработки сопровождается таким же четырехкратным снижением способности ионов кальция связываться этим образцом (перикард 2). Общее число ионизируемых групп 0,610¹⁷ на 1 квадратный сантиметр является критическим. С увеличением этого числа резко возрастает способность ксеноматериала к преципитации кальция.

Таким образом, при небольшом количестве образцов (четыре) получение статистически достоверного результата оказывается возможным уже через шесть часов (с учетом времени подготовки установки КОТ к работе). В то время как известная методика (прототип) занимает около трех суток.

Предлагаемый способ определения резистентности биоматериала ксеноклапанов сердца к кальцификации позволяет, не снижая точности, значительно сократить сроки проведения исследования за счет специфического определения ионизируемых групп боковых цепей макромолекул биополимеров ксеноткани протеза.