способ определения галактозы в сыворотке крови

Формула изобретения

Способ определения галактозы в сыворотке крови, включающий проведение тонкослойной хроматографии сыворотки крови на пластине с силикагелем, двукратное элюирование в смеси растворителей, с последующей обработкой химическим реагентом для проявления сахаров, отличающийся тем, что на пластину для тонкослойной хроматографии наносят смесь сыворотки крови с водой в соотношении 1 2, в качестве элюента используют смесь растворителей гексан-этанол в объемном соотношении (1 3) (2 5) соответственно, а проявление ведут анилинфталатом.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биохимии и ветеринарии и касается способа определения гексоз, например галактозы, в сыворотке крови для ранней диагностики нарушений минерального обмена.

В клинической практике наиболее распространено определение углеводсодержащих белков сыворотки крови по одному из входящих в их состав компонентов, например гексозам. Из наиболее применяемых способов для клинико-диагностических лабораторий является определение гексоз (маннозы, галактозы), связанных с белками, фотометрическими методами с использованием триптофана и орцинового реактива, после гидролиза гликопротеидов и гликозаминогликанов сыворотки крови серной кислоты. (В.Г.Колб, В.С.Камышников. Справочник по клинической химии. Минск: Беларусь, 1982, с. 182-188).

Известны хроматографические способы определения (и разделения) гексоз в тонких слоях с применением различных сорбентов и элюирующих систем. На силикагеле в системе растворителей бензол-метанол-уксусная кислота (1:3:1), метилэтилкетон-метанол-уксусная кислота (3:1:1) определен ряд гексоз, в том числе галактоза и манноза (А.А.Ахрем, А.И.Кузнецова. Тонкослойная хроматография. М. Наука, 1964, с. 86).

Известен способ определения гексоз, например глюкозы, в биожидкостях с применением реактива, содержащего в своем составе глюкозооксидазу, пероксидазу, фосфорный буфер и хромоген, включающий раствор амидопирина и солянокислого анилина в этаноле, стабилизированный раствором солянокислого гидроксиламина (патент РФ N 2009499, кл. 5 G 01 N 33/50).

Известно определение гексоз в сыворотке крови по Эрссеру и Эндрю. Сыворотку крови освобождают от белка добавлением пикриновой кислоты (75 мг/л). Окрашенную в желтый цвет жидкость после центрифугирования хроматографируют. Образцы наносят (по 10 мкл) на пластинку и подвергают двухкратному элюированию в системе этилацетат-пиридин-вода (6:3:2) одновременно с этанолами. После высушивания хроматограмму опрыскивают раствором п-аминобензойной кислоты, нагревают при 60-90^oC и наблюдают пятна альдез. (М.Шаршунова, В.Шварц, Ч. Михалец. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии. Ч. 2. М. Мир, 1980, с. 514).

Недостатком данного способа является то, что методика осложнена предварительной операцией отделения белка от сыворотки крови пикриновой кислотой.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ определения гексоза в сыворотке крови орциновым методом после гидролиза серной кислотой. Гликопротеиды, содержащие гексозы, выделяют из сыворотки крови этанолом с последующим центрифугированием. Белковый осадок растворяют в 0,1н растворе едкого натра, прибавляют орциновый реактив (раствор орцина в серной кислоте), перемешивают, нагревают на водяной бане при 80^oC 15 мин, охлаждают и пробы, окрашенные в розовый цвет колориметрируют на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром (при длине волны 500-560 нм) в кювете с толщиной слоя 10 мм. Расчет производят по калибровочному графику. Стандартный раствор гексоз конц. 1 г/л готовят из галактозы и маннозы, взятых в равных весовых количествах. (В.Г.Колб, В.С.Камышников. Справочник по клинической химии. -Минск: Беларусь, 1982, с. 185).

Недостатком данного способа является громоздкость и длительность проведения анализа (не менее 8 ч). Способ предусматривает обязательные операции: отделение белкового осадка этанолом с последующим центрифугированием, выделение гексоз из гликопротеидов путем их гидролиза серной кислотой.

Таким образом, известные способы и приведенный выше не позволяют определять гексозы непосредственно в сыворотке крови без предварительной ее обработки.

Задачей изобретения является проблема совершенствования способа определения гексоз в сыворотке крови, таких, как, например, галактоза без предварительной ее обработки (отделения белкового осадка и гидролиза углеводсодержащих белков).

Эта задача решается способом определения галактозы в сыворотке крови с использованием тонкослойной хроматографии путем нанесения исследуемой пробы на стартовую линию пластинки с силикагелем, двухкратного элюирования в смеси растворителей с последующим обнаружением анилинфталатом, в котором на пластинку, например силуфол, наносят водный раствор сыворотки крови, а в качестве элюента используют смесь растворителей гексан-этанол в объемном соотношении (1^oC3):(2^oC5) соответственно.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. К 1 объему сыворотки крови прибавляют 2 объема воды и водный раствор наносят на пластинку силуфол. Пластинку подвергают двухкратному элюированию в смеси растворителей гексан-этанол в объемном соотношении (1^oC3):(2^oC5) соответственно и после сушки на воздухе проявляют анилинфталатом при температуре 90-100^oC в течение 10 мин.

Пример 1. К 1 объему сыворотки крови прибавляют 2 объема воды, затем на стартовую линию пластинки силуфол наносят 10 мкл водного раствора сыворотки. Одновременно на стартовую линию наносят 10 мкл этанола (раствора галактозы). Пластинку сушат на воздухе и подвергают двухкратному элюированию на расстоянии от старта 10 см в системе растворителей гексан-этанол в объемном соотношении (1^oC3) соответственно. После каждого элюирования пластинку сушат на воздухе. Затем пластинку опрыскивают анилинфталатом, высушивают от проявителя, нагревают при температуре 90-100^oC не менее 10 мин и наблюдают проявление темно-бурых пятен галактозы. Определяют R_f: для стандартного образца R_f 0,72; для исследуемой пробы сыворотки крови одно пятно, R_f 0,72.

Пример 2. К 1 объему сыворотки крови прибавляют 2 объема воды, затем на стартовую линию пластинки силуфол наносят 10 мкл водного раствора сыворотки крови. Одновременно на стартовую линию наносят 10 мкл этанола (раствора галактозы). Пластинки сушат на воздухе и подвергают двухкратному элюированию на расстоянии от старта 10 см в системе растворителей гексан-этанол в объемном соотношении (2^oC5) соответственно. После каждого элюирования пластинку сушат на воздухе. Затем пластинку опрыскивают анилинфталатом, высушивают от проявителя, нагревают при температуре 90-100^oC не менее 10 мин и наблюдают появление темно-бурых пятен галактозы. Определяют R_f: для стандартного образца R_f 0,72; для исследуемой пробы сыворотки крови одно пятно, R_f 0,72. Для количественного определения галактозы в сыворотке крови исследуемых проб расчет проводят по калибровочному графику. Для построения калибровочного графика используют стандартные образцы раствора галактозы следующих концентраций (мкг/мл): 5, 10, 15, 20, 25, 30. Калибровочную кривую строят на основании количества взятого вещества (в мкг) и найденного размера площади пятна (в мм²), руководствуясь общеизвестными принципами (А.А.Ахрем, А.И.Кузнецова. Тонкослойная хроматография. М. Наука: 1964, с. 52).

Таким образом, предлагаемый способ определения галактозы в сыворотке крови позволяет в течение 40-45 мин без предварительной ее обработки (отделения белкового осадка и гидролиза углеводсодержащих белков серной кислотой) сразу получить данные о наличии галактозы в малом количестве (10 мкл) исследуемой пробы качественно и количественно.

Предлагаемый способ за счет экспрессности и большой чувствительности (до 0,005 мкг вещества) может быть использован для ранней диагностики нарушений минерального обмена, которые клинически проявляются в форме остеодистрофии.