белок, содержащий молибдокофактор, и способ его получения

Формула изобретения

1. Белок, содержащий молибдокофактор из семян гороха с мол. м. 300 кДа, состоящий из двух субъединиц, имеющий изоэлектрическую точку pi 5,0, максимум флюоресценции при 440 нм при длине волны возбуждения 360 370 нм, а также пик в спектре поглощения милобдокофактора, диссоциированного от белка, при окислении щелочным перманганатом калия при 360 нм.

2. Способ получения белка, содержащего молибдокофактор, по п. 1, предусматривающий измельчение семян гороха, экстракцию, дробное осаждение блоков сульфатом аммония с последующей очисткой методами ионообменной хроматографии, гельфильтрации и ковалентной хроматографии.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биохимии, биотехнологии, а именно к получению и изучению белков, содержащих птериновый молибдокофактор, и может быть использовано в энзимологии, биотехнологии и медицине.

Молибдокофактор (Moco) представляет собой птериновое производное (в тетрагидроформе) с боковой цепью в 6 положении, содержащее дитиольную и фосфатную группу в составе боковой цепи.

Может быть использован в научных исследованиях для установления структуры и свойств Moco различного происхождения, а также молибдоферментов (Mo-ферментов) /нитратредуктаза, ксантиноксидаза, ксантиндегидрогеназа, альдегидоксидаза, форматдегидрогеназа и ряд других ферментов/, активным центром которых является Mo-Co. Перспективно также использование кофактора при диагностике и лечении ряда неврологических и урологических заболеваний, связанных с недостатком и нарушениями его биосинтеза, а также в качестве теста в селекционно-генетических исследованиях зернобобовых культур.

До настоящего времени для диагностики и лечения использовали выделенный из разных источников очищенный Moco. Поэтому в качестве белка, содержащего молибдокофактор, который следует рассматривать как прототип, можно использовать фермент ксантиндегидрогеназу (КДГ), полученный из зерен пшеницы.

Использование в качестве источника Moco зерен пшеницы предусматривает отделение зародышей от эндосперма, экстракцию измельченных зародышей буферным раствором, содержащим соль молибдена, прогревание экстракта при 55 64^oC с последующим охлаждением и осаждением балластных белков. Белки надосадочной жидкости осаждают сульфатом аммония, отделяют, растворяют в трис-буфере pH 8,2 и обессоливают, пропуская через сефадекс G-25. Очистку ведут методами ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и изоэлектрической фокусировки. В результате получают ксантиндегидрогеназу белок, содержащий Moco, с молекулярной массой 220 кДа. Белок состоит из двух идентичных субъединиц. Изоэлектрическая точка 4,6, pH-оптимум 8. Проявляет ксантиндегидрогеназную, активность.

Ксантиндегидрогеназа не всегда может быть использована в качестве биомедпрепарата, так как в состав данного фермента, кроме Moco, также входят другие простетические хромофорные группы (например, флавины, железо-серные центры и т.д.), экзогенное поступление которых может быть не желательным для организма.

Задачей изобретения является получение нового Moco-содержащего белка, который содержит кофактор в активном и стабильном состоянии и не содержит других хромофорных групп. Такая задача возникла в связи с тем, что очищенные препараты Moco нестабильны, что приводит к потере функциональной активности и лечебных свойств кофактора. Авторами данной заявки была найдена форма Moco, связанного с белком, что делает такую форму предпочтительной при клиническом использовании кофактора благодаря ряду преимуществ этой формы Moco.

Задача изобретения решается белком, содержащим Moco, полученным из семян гороха. Белок имеет молекулярную массу 300 кДа и состоит из двух идентичных субъединиц по 150 кДа каждая. Изоэлектрическая точка белка (pI) равна 5,0. Максимум флюоресценции 440 нм при длине волны возбуждения 360 370 нм. Спектр поглощения Moco, диссоциированного от белка, с соответствующим окислением щелочным перманганатом обнаруживает пик при 360 нм. Белок не проявляет ферментативной активности. Кроме Moco, хромофорных групп не содержит/ Белковая форма кофактора обеспечивает сохранение его нативной структуры и функциональной активности благодаря прочной связи с белком и протекторным свойствам белкового окружения. Молибдокофактор на белке термостабилен и сохраняет активность при хранении, лиофилизации, замораживании и т.п.

Способ получения вышеописанного белка, содержащего Moco, не имеет прототипа, так как белок получают впервые. Способ предусматривает измельчение семян гороха, экстракцию буферным раствором. Белок выделяют из экстракта дробным высаливанием сульфатом аммония. После обессоливания белок очищают с использованием методов ионообменной хроматографии, гельфильтрации и ковалентной хроматографии.

Функциональную активность молибдокофактора определяют в реакции комплементации с дефектной нитратредуктазой (не содержащей Moco) мутанта гриба Neurospora cfrassa nit-1 по известной методике. При необходимости количественного определения кофактора (данные таблицы очистки) применяют методику комплементации на холоду в течение 20 ч. За единицу активности Moco принимают количество нмолей нитритов, образовавшихся в минуту, стандартным количеством нитратредуктазы nit-1, на мг внесенного Moco-содержащего белка.

Спектры поглощения белка регистрируют на спектрофотометре Hitachi 557 в ультрафиолетовой и видимой областях. Спектры флюоресценции регистрируют на спектрофлюориметре Hitachi MPR-4 в диапазоне 400 460 нм, при длине волны возбуждения 360 370 нм. Изобретение поясняется следующим примером.

Пример. Навеску мелкоизмельченной муки гороха 40 г "Малиновка" экстрагируют в 200 мл 0,05 М калий-фосфатного буфера pH 7,2, содержащего 1 mM ЭДТА, в течение 60 мин при интенсивном перемешивании. Соотношение навески муки и буфера составляет 1:5 (г/мл). Экстракт отжимают через 4 слоя капрона и центрифугируют при 16000 x g в течение 25 мин на холоду. Осадок отбрасывают, а супернатант используют для процедуры дробного высаливания сульфатом аммония в интервале 20 40%

К 100 мл супернатанта при перемешивании добавляют сульфат аммония до концентрации 20% насыщения, перемешивают в течение получаса, затем центрифугируют при 16000 х g в течение 15 мин. К полученному супернатанту вновь добавляют сульфат аммония до концентрации 40% насыщения, перемешивают в течение получаса и центрифугируют при 16000g также в течение 15 мин. Осажденные белки перерастворяют в минимальном количестве 0,05 М калий-фосфатного буфера pH 7,2, содержащего 1 mM ЭДТА (около 6 мл) и наносят на обессоливающую колонку Sephadex G-25 coarmse (50x2,5 см), уравновешенную тем же буфером, для освобождения от сульфата аммония.

Обессоленный белковый раствор объемом 45 мл наносят на колонку для ионообменной хроматографии DEAE Toyopearl 650 M (2,5 x 10 см), уравновешенную 0,02 М калий-фосфатным буфером pH 7,2, содержащим 1 mM ЭДТА. Колонку промывают исходным буфером до отмывки от балластных белков. Сорбированный на поверхности ионообменника Moco-содержащий белок элюируют градиентом 0 0,4 M KCl.

Полученные после ионообменной хроматографии фракции, содержащие Moco активность, концентрируют на колонке DEAE Toyopearl 650 M размером 0,6 x 7 см, уравновешенной 0,02 М калий-фосфатным буфером pH 7,2, содержащим 1 mM ЭДТА. Для этого активные фракции объединяют и белковый раствор в количестве 30 мл разбавляют до 100 мл калий-фосфатным буфером, pH 7,2, содержащим 1 mM ЭДТА, для уменьшения концентрации KCl. Раствор наносят на колонку и элюируют тем же буфером, но содержащим 0,2 М KCl. Затем сконцентрированные активные фракции Moco-содержащего белка в объеме 5 мл наносят на колонку с сефакрилом S-200, уравновешенную 0,02 М калий-фосфатным буфером с 1 mM ЭДТА. Полученные 15 мл активной Moco-содержащей фракции наносят на колонку с активированной Thiol-Sepharose 4 B объемом 4 x 1 см, уравновешенную калий-фосфатным буфером 0,02 М, pH 7,4 с 1 mM ЭДТА. Элюцию Moco-содержащего белка проводят калий-фосфатным буфером, содержащим 65 mM дитиотрейтола.

Препарат белка, содержащего молибдокофактор, позволяет сохранить активность Moco даже при прогревании 95^oC в течение 5 мин в аэробных условиях /для сравнения время жизни низкомолекулярного Moco, не связанного с белком или ферментной системой в анаэробных условиях, около 15 мин. То есть получение целевого продукта в виде Moco-содержащего белка позволяет защитить кофактор от инактивации и хранить целевой продукт в течение длительного времени без потери функциональной активности.

Определение молекулярной массы активного белка, полученного методом гельхроматографии на HW 55 Toyopearl, указывает на величину, соответствующую 300 кДа.

Денатурирующий электрофорез в 10% ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия, гомогенного препарата Moco-содержащего белка выявляет одну полосу с молекулярной массой 150 кДа, что указывает на наличие димерного состава белка (фиг.1).

Нативный Moco-содержащий белок не имеет специфической флюоресценции с максимумом при 450 нм, при длине волны возбуждения 370 нм, характерной для окисленных форм Moco, выделенного из других источников. Это позволяет считать, что птерин молибдокофактора находится в восстановленной тетрагидро- или дигидроформе. В то же время спектр флюоресценции окисленного, но не отделенного от белка молибденокофактора имеет характерный максимум флюоресценции при 440 нм, при длине волны возбуждения 360 370 нм (фиг.2).

Спектры поглощения гомогенных препаратов (фиг.3) Moco-содержащего белка указывают на отсутствие каких-либо хромофорных группировок в составе субъединиц.

Спектры поглощения диссоциированного от белка молибдокофактора с последующим окислением щелочным перманганатом (для выявления окисленного птеринового производного) обнаруживают характерный пик при 360 нм (фиг.4).

Для медицинского и диагностического использования применяют очищенный Moco и его производные, что связано с большими трудностями в процессе очистки и получения активного препарата Moco в виду его нестабильности в низкомолекулярной форме. Очищенный низкомолекулярный Moco в активной форме можно сохранить лишь на специальных носителях (например, активированной матрице Thiol-Sepharose 4B) для защиты SH групп от окисления и инактивации Moco. В растворе без носителя даже при наличии различных протекторов и антиоксидантов и создании анаэрочных условий низкомолекулярный Мосо сохраняет активность 15 30 мин. Следует отметить, что и ферменты, содержащие Moco, также нестабильны и требуют для хранения специальных условий, а большинство очищенных Moco-содержащих ферментов теряют активность в течение нескольких минут даже при соблюдении всех оптимальных условий при их очистке. Например, такие Moco-содержащие ферменты, как формилметанофурандегидрогеназа метаногенных архебактерий и формиатдегидрогеназа из Clostridium sp. в аэробных условиях теряют каталитическую активность через 1 2 мин (Adams, 1994).

Предлагаемый в заявке белок, содержащий Moco, позволяет сохранять активность кофактора даже в аэробных условиях в течение 3 5 сут (в зависимости от температуры). Кроме того, белковое "окружение" позволяет защитить кофактор от инактивации и при тепловом шоке (прогревание на водяной бане 70 90^oC в течение нескольких минут). В замороженном состоянии препарат Moco-содержащего белка хранится не менее 6 мес без потери активности кофактора.

Процедура определения активности молибдокофактора в обнаруженном белке включает следующие две стадии: прогревание препарата для "разворачивания" белковой глобулы и доступности кофактора для комплементации и комплементацию Moco с нитратредуктазой экстракта мутанта nit-1 гриба N. crassa, дефектной по Moco с последующим определением активности вновь образовавшейся нитратредуктазы (Nason et al. 1970; Hawkes, Bray, 1984).

Пример. 60 мкл Moco-содержащего белка в смеси, состоящей из 50 мM калий-фосфатного буфера, pH 7,4 с добавками 1 мМ Na ЭДТА и 3 мМ восстановленного глутатиона, прогревают на водяной бане 90^oC 90 с. Компленетацию Moco с экстрактом мутанта N. crassa nit-1 проводят следующим образом: к 60 мкл прогретого экстракта добавляют 100 мкл смеси, состоящей из экстракта мутанта N. crassa nit-1 (80 мкл), раствора Na₂MoO₄ 0,1 М (20 мкл) и оставляют на 40 мин при 20^oC. Активность вновь образовавшейся in vitro нитратредуктазы определяют добавлением к комплементационной смеси 100 мкл 110^-4М раствора FAD, 20 мкл 210^-4М раствора NADPH и 100 мкл 0,1 М раствора NaNO₃ и инкубируют 20 мин на водяной бане при 30^oC. По истечении времени пробирки кипятят для остановки реакции и удаления избытка NADPH. Затем смесь охлаждают и проводят определение количества образовавшихся в ходе реакции нитритов. Для этого к аликвоте реакционной смеси добавляют 0,5 мл сульфаниловой кислоты (6 г кислоты и 1 л 20% раствора соляной кислоты) и 0,5 мл N-1-нафтилэтилендиамина солянокислого) /1,2 г на 1 л H₂O/. Через 15 мин, необходимых для развития окраски, количество нитритов определяют спектрофотометрически по поглощению при 548 нм. Для оценки содержания нитритов пользуются калибровочной кривой, построенной с использованием в качестве стандарта азотнокислого натрия. Для количественного определения кофактора применяют методику комплементации на холоду в течение 20 ч (Hawkes, Bray, 1984). За единицу активности Moco принимают количество нмолей нитритов, образовавшихся в 1 мин, в ходе реакции комплементации с дефектной нитратредуктазой мутанта гриба N. crassa nit-1, в расчете на 1 мг внесенного Moco-содержащего белка. Данные определения функциональной активности кофактора приведены в таблице очистки Moco-содержащего белка.