средство для избирательного удаления из популяции лимфоцитов млекопитающих активированных антигеном или митогеном т- и в-лимфоцитов

Формула изобретения

Применение 2-метил-1-октадецилглицеро-(3)-фосфохолина для избирательного удаления из популяции лимфоцитов млекопитающих активированных антигеном или митогеном Т- и В-лимфоцитов.

Описание изобретения к патенту

Важными элементами иммунной системы у млекопитающих являются T- и B-лимфоциты. Во время своего развития последние образуют специфические рецепторы для антигенов, так что каждый такой лимфоцит для оставшейся части своей жизни приобретает специфичность для единственного антигена. Находящиеся в состоянии покоя лимфоциты (маленькие лимфоциты), включая клетки памяти, циркулируют через ткани тела и лимфоорганы, а также через жидкости организма и поэтому контролируют организм относительно появления их антигенов. Как только появляется специфический антиген, происходит индуцированная антигеном пролиферация лимфоцитов с образованием активированных больших лимфоцитов. Эту пролиферацию можно осуществить также в пробирке культивированием лимфоидных клеток со специальными антигенами. При помощи такой же системы можно показать также, что митогенные лектины (следовательно, протеины), которые связывают и сшивают специфические детерминанты поверхностей клеток, состоящие из углеводов, стимулируют также лимфоидные клетки. Наконец, активирование лимфоцитов или антигенами или митогенами приводит к созреванию лимфоцитов до лимфобластов. Экспериментально митогенное стимулирование лимфоцитов можно называть, например, фитогемагглютинином (РНА) и конкавалином А (Con A) в случае T-клеток, как человеческого, так и животного происхождения, липополисахаридами (LPS) в случае B-клеток.

В связи с этим первичный иммунный ответ является результатом стимулирования специфических соответственно для антигена или митогена лимфоцитов, так что последние из состояния покоя переходят в активированное состояние, становятся большими лимфоцитами, которые пролиферируют и дифференцируются на клетки эффективного органа (например, T-клетки с дитотоксическими или другими функциями или образующие антитела плазматические клетки, которые образуются из зрелых B-клеток) или клетки памяти. Активированием находящихся в состоянии покоя клеток памяти вызывают в этом случае второй иммунный ответ, который снова вызывает клетки эффективного органа и клетки памяти.

Благодаря первичному или вторичному иммунному ответу появляются как желательные, так и нежелательные последствия. К нежелательным в большинстве случаев последствиям относятся, например, отторжения трансплантата, аллергические реакции и т.п. Вообще их можно назвать как приобретенные, вызванные внешними антигенами иммунологические заболевания или симптомы.

Если бы удалось избирательно выделять активированные лимфоциты, не изменяя отрицательно свойства находящиеся в состоянии покоя лимфоцитов, то можно было бы таким путем препятствовать вообще приобретенным иммунологическим заболеванием, которые вызывают внешние антигены. Таким образом можно было бы препятствовать как аллергическим реакциям, так и отторжениям трансплантата.

Задача изобретения получение средства, которое может выводить специфически активированные лимфоциты, не причиняя вреда находящимся в состоянии покоя лимфоцитам, особенно не оказывая вредного влияния на находящиеся в состоянии покоя лимфоциты относительно их стимулирования антигенами или митогенами.

Задача решается путем применения 2-метил-1-октадецил-глицеро-(3)-фосфохолина, обозначаемого ниже как ET180CH₃, для выделения активированных антигенами или митогенами лимфоцитов у млекопитающих или применением ET18OCH₃ для получения лекарственного средства для выделения активированных антигенами или митогенами лимфоцитов.

ET18OCH₃ и его получение известны. Далее известно, что ET180CH₃ можно применять как средство против опухолей (патент ФРГ-А1 2619686) и против рассеянного склероза (патент ФРГ-А1 3530767). Из них нельзя было сделать вывод о специфическом выделении активированных лимфоцитов, как это показано изобретением. Изобретение основывается на открытии, что ET180CH₃ выделяет избирательно активированные антигеном или митогеном лимфоциты.

Однако даже более продолжительное воздействие ET180CH₃ не оказывает отрицательного влияния на находящиеся в состоянии покоя лимфоциты и позволяет осуществлять их дополнительную антигенную и митогенную стимуляцию. В частности, было найдено, что и более продолжительное применение ET180CH₃ не производит низких отрицательных эффектов на иммунную реакцию на живом организме, а именно, как для B- так и для T-клеток-реакций.

Поэтому новое применение по изобретению позволяет удалять избирательно активированные большие лимфоциты и подавлять тем самым вызванную этими лимфоцитами иммунную реакцию. Так как одновременно нет отрицательного влияния в состоянии покоя лимфоциты, средство по изобретению не причиняет вреда самой иммунной системе. Это представляет существенное преимущество по сравнению с известными до сих пор иммунноподавляющими средствами, которые всегда оказывали влияние на свою иммунную систему и тем самым решительно ослабляли организм в его защитной способности против других антигенов и митогенов.

Эффективная доза ET18OCH₃ зависит от вида назначения. В общем, человеку применяют дозу между 10 и 1000 мг/день при оральном назначении. При этом способе назначения, который осуществляют, например, растворением активного вещества в подходящем носителе (как молоко), используют преимущественно 30 300 мг/чел./дн. При назначении влияния эти дозы могут быть еще несколько повышены. При локальном назначении и здесь принимают во внимание обычно применяемые концентрации активного вещества.

Изобретение поясняется фиг 1 5, где:

фиг. 1, A встройка ³H-тимидина как меры для активности лимфоцитов при добавке активаторов клеток;

фиг. 1, B встройка ³H-тимидина через лимфоциты под влиянием активаторов клеток при добавке ET18OCH₃ в первый день;

фиг. 1,C изобретение аналогично 1B при добавке ET18OCH₃ во второй день;

фиг. 2,A встройка ³H-тимидина в стимулированные лимфоциты.

фиг. 2B изобретение аналогично фиг. 11A, но при добавке ET180CH₃ при стимулировании клеток лишь после ET180CH₃ назначения;

фиг. 2C контрольные результаты без стимулирования и добавки ET18oCH₃;

фиг. 3 влияние ET18OCH₃ на образование вырабатывающих специфические антитела клеток;

фиг. 4 встройка тимидина через T-лимфоциты с предварительной обработкой и без предварительной обработки ET18oCH₃;

Фиг. 5 аналогичные результаты как фиг. 4 при B-лимфоцитах.

Пример 1. Из клеток селезенки Бальб C мышей выделяли T-лимфоциты пассажем через найлоновую шерсть. Последние активировали затем в культуре с поликлональными активаторами T-клеток Con A или с анти-CD₃-антителами или для контроля с активатором B-клеток LPS. Соответственно к половине культур добавляли через 1 или 2 дн ET18OCH₃ (10 мг/мл). Другая половина служила для контроля. На 3-й день культивирования ко всем культурам добавляли ³H-тимидин и его встройку измеряли на 4-й день.

Фиг. 1,A показывает ожидаемое стимулирование клеток в форме увеличенной встройки ³H-тимидина после поликлонального активирования с Con A или с анти-С₃-антителами. Повышение на несколько градусов после добавки митогена B-клеток LPS означает, что в культурах были еще остаточные B-лимфоциты. Все эти результаты активирования были полностью подавлены добавкой к культурам ET180CH₃ в 1-й день (фиг. 1,B), добавкой на 2-й (фиг. 1C) почти также полностью.

Отсюда вытекает, что ET180CH₃ в пробирке практически полностью препятствует пролиферации T- и B-лимфоцитов мыши. Использованные активаторы приблизительно через 24 ч приводят к первому делению клеток, так что ET180CH₃, добавленный к этому моменту, может препятствовать также вхождению клеток в первую S-фазу. Однако так как и добавка ET18OCH₃ через 48 ч вызывает еще почти полное торможение, это доказывает то, что и еще пролиферирующие клетки высокочувствительны к ET180CH₃.

Пример 2. Чтобы установить, можно ли ET18OCH₃ в соответствующих концентрациях использовать для того, чтобы выделять из популяции лимфоцитов только активированные и профилирующие клетки специфически, оставлять, напротив, остающиеся в состоянии покоя клетки, были осуществлены следующие опыты.

Очищенные через найлоновую шерсть T-лимфоциты Бальб C мышей (H-2 d) совместно культивировали с клетками селезенки C57B16 мышей (H-2 b) в смысле "реакции смешанных лимфоцитов". К половине культур на 3-й день добавляли ET18OCH₃ (10 мг/мл), другая половина служила в качестве контроля. Другая контрольная культура состояла из одних Бальб C N-лимфоцитов и без ET18OCH₃. Через 7 дн культивирования все клетки для удаления ET18OCH₃ промывали и снова при культивировании с клетками C57B16 мышей или с клетками CBA мышей (H-2^k) стимулировали поликлональными активаторами T-клеток (Con A или анти-CO₃-антителами или метогеном B-клеток LPS. Через 3 дня добавляли затем 3H-тимидин и определяли его встройку после второго дня.

Фиг. 2, A показывает результаты с контрольными культурами без ET180CH₃. При этом следует отметить, что и культуры без других добавок уже показывали относительно высокую back ground встройку тимидина, который маскировал дальнейшее увеличение после стимулирования. Как единственный значительное повышение встройки давал здесь Con A.

На фиг. 2, B показаны результаты культивирования с добавкой ET180CH₃. Неспецифическая back ground величина здесь полностью исчезла, так как были удалены неспецифические пролиферирующие клетки. Обратно стимулированные с C57B16 клетками культуры также не показывали больше встройки ³H-тимидина. Однако достойна внимания реакция на новое аллогенное стимулирование с СВА клетками (и прежде всего очень хорошая реакция на Con A и Анти CD₃ антитела LPS) это не давало никакого стимулирования, так как B-лимфоциты в ходе культивирования отмирали.

Фиг. 2,C показывает результаты с совершенно нестимулированными контрольными клетками и без ET18OCH₃. Отсутствие значительных успехов также с Con A можно объяснить тем, что нестимулированные лимфоциты мышей переносят только плохо 9-дневный период культивирования.

Эти результаты показывают, что те T-лимфоциты, которые были активированы для пролиферации особенно алло-антигеном (здесь H-2b C57B16 мышей), удаляли полностью в присутствии ET-18. Однако в противоположность этому T-лимфоциты других специфичностей в противоположность этому Т-лимфоцитов других специфичностей антигена, которые поэтому оставались в состоянии покоя, не только сохранялись, но их можно было также дополнительно еще очень хорошо активировать для пролиферации. Это было подтверждено реакцией на СВА, Con A анти-CD₃ -антителе. Что совершенно нестимулированные лимфоциты (фиг. 2,C) и без ET180CH₃ больше нельзя было стимулировать показывает, что ET180CH₃ вообще не повреждает находящиеся в состоянии покоя клетки.

Следовательно, этот опыт показывает, что при помощи ET18OCH₃ можно избирательно удалять специфически активированные антигеном T-клеточные клоны, что однако T-клетки других специфичностей антигена от этого не страдают и остаются вполне реактивными.

Пример 3. C57B16 мыши были иммунизированы каждая 100 мг классического антигена Гаптена TNP-KLH (тринитрофенил кейхол лимпет гемоцинин). Через 8 недель животным была сделана инъекция вспомогательного средства по 30 мг TNP-KLH. Одновременно с этим и затем в течение всего 5 дн одна часть животных получила 1 мг ET180CH₃ на одно животное в день в молоке при помощи желудочного зонда, другая часть получила молоко без ET180CH₃. Через неделю после вспомогательного средства или после первого приема ET180CH₃ были взяты селезенки животных. Селезенки неиммунизированных животных с ET180CH₃ и без ET180CH₃ служили в качестве контроля.

С одной частью клеток селезенки были осуществлены прямые и косвенные гемолитические тесты на пластинке для обнаружения B-лимфоцитов, которые продуцируют анти-TNP-специфические антитела класса Igm или IgG.

Фиг. 3 показывает, что ET18OCH₃ не оказывал влияния на образование продуцирующих специфические антитела в живом организме. Специфичность данных показана через небольшое число продуцирующих антитела клеток у неиммунизированных животных, которое соответствует background-величинам.

Этот результат показывает, что ET18OCH₃ не оказывает никакого тормозного действия в живом организме на первичную или вторичную иммунную реакцию, измеренную образованием продуцирующих антитела B-лимфоцитов после приемов антигена.

Другую часть вышеназванных клеток селезенки культивировали в пробирке и смешивали с KLH (повторное стимулирование T-лимфоцитов) или с конканавалином A (общий митоген T-клеток) или с TN P-KLH (повторное стимулирование B-лимфоцитов) или с SRBC (эритроциты овцы для первичного стимулирования B-лимфоцитов в пробирке).

Реакции T-клеток определяли в тесте с пролиферацией через встройку ³H-тимидина, реакции B-клеток определяли в гемолитическом тесте с пластиной.

Фиг. 4,B показывает встройку тимидина KLH повторно стимулированных с Con A-активированных T-лимфоцитов, слева животных без предварительной обработки ET180CH₃, справа с предварительной обработкой ET180CH₃ на живом организме. Это показывает, что повторное стимулирование с KLH зависит от дозы и является специфическим. Предварительная обработка на живом организме животных при помощи ET180CH₃ не оказывает никакого отрицательного действия на повторное стимулирование T- клеток или на митогенное стимулирование.

Фиг. 5 показывает результаты с B-лимфоцитами. Повторное стимулирование с TNP-KLH является специфическим, как и первичное стимулирование с SPBC. Здесь клетки из предварительно обработанных с ET180CH₃ животных реагируют по меньшей мере так же хорошо, как клетки из контрольных животных, поэтому как находящиеся в состоянии покоя T-клетки, так и находящиеся в состоянии покоя B-клетки сохраняют свою стимулирующую способность и после назначения ET18OCH₃.