способ иммунногистохимической детекции протеинов на гистологических срезах

Формула изобретения

Способ иммуногистохимической детекции протеинов на гистологических срезах, включающий их регидратацию и удаление из них остатков парафина, блокирование эндогенной пероксидазы и затем неспецифической сорбции иммуноглобулинов, обработку гистологических срезов первичными антителами с последующей инкубацией их вторичными антителами, обработкой комплексом авидин-пероксидаза, проявлением пероксидазной активности, окраской и детекцией протеинов по наличию золотисто-коричневого окрашивания, отличающийся тем, что перед обработкой гистологических срезов первичными антителами в их раствор дополнительно вводят полиэтиленгликоль 6000 до конечной концентрации в растворе 5%

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии.

Известен способ усиления чувствительности иммуногистохимического метода выявления антигенов путем применения солей некоторых металлов на конечном этапе метода. Следует отметить, что применение их не столько повышает чувствительность метода, сколько контрастирует искомые объекты, переводя золотисто-коричневую окраску их, получаемую без применения солей металлов, в сине-черные цвета. Отрицательными сторонами метода являются возрастание фонового окрашивания срезов, а также то, что некоторые соли металлов, например четырехокись осмия, являются токсичными веществами, в силу чего они малодоступны широкому применению (Дж. Полак и С.Ван Норден. М. Мир, 1987).

Известен способ, выбранный в качестве прототипа, повышения детекции антигенов на гистологических срезах с помощью низких значений pH растворов, используемых в иммуногистохимическом методе, в частности и на этапе обработки гистологических срезов первичными антителами [1] Однако известно, что в таких случаях отмечается неспецифическое окрашивание срезов. Есть данные, что использование ацетатных буферов pH 5,0-5,1 не повышает чувствительность метода, что связано с тем, что авидность антигенов и антител при низких значениях pH резко снижается (Т. Нго и Р.Ленхофф. М. Мир, 1988.)

Задача изобретения заключается в увеличении чувствительности иммуногистохимической детекции протеинов в гистологических срезах путем повышения вязкости раствора, что увеличивает, ускоряет и усиливает сцепление искомых антигенов с применяемыми антителами.

Поставленная задача достигается тем, что в способе, основанном на использовании иммунопероксидазной реакции на этапе обработки гистологических срезов первичными антителами в последние дополнительно вводят 5-ный раствор полиэтиленгликоля-6000 (ПЭГ-6000).

Способ иммуногистохимической детекции протеинов на гистологических срезах основан на следующем. Иммуногистохимический метод представляет собой высокоспецифическую иммунную реакцию для идентификации антигенов в тканях. Любые тканевые антигены, против которых получены антитела, могут быть наглядно представлены с помощью распознающих их антител, меченных, например, ферментом пероксидазой хрена. Основные сложности в развитии иммунопероксидазного метода состоят в том, чтобы соединить пероксидазу с антителом без потери ферментной и антительной активности данного конъюгата. Высокая эффективность сцепления является решающей в этом процессе, поскольку немеченные антитела будут эффективно конкурировать с меченными пероксидазой антителами в иммуногистохимической реакции.

Сущность предлагаемого способа заключается в следующем.

1. Регидратация срезов и удаление из них остатков парафина. Основной задачей данного этапа является обезвоживание и максимальное удаление парафина из тканей, так как минимальные остатки последнего приводят к повышению фонового окрашивания. Для этого срезы проводят через три порции о-ксилола, абсолютный этанол, спирт 70^o и 56^o, а также забуференный физиологический раствор (ЗФР) по 3 мин в каждой порции жидкости.

2. Блокирование эндогенной пероксидазы осуществляют путем внесения на срез нескольких капель 3-ной перекиси водорода на 10 мин.

3. Блокирование неспецифической сорбции иммуноглобулинов достигают путем нанесения на срез лошадиной сыворотки в разведении 1:20 на 30 мин.

4. Этап обработки гистологических срезов первичными антителами концентрации 8 мкг/мл, разведенными в ЗФР, с добавлением 3-ного альбумина и 0,01-ного азида натрия. К полученному раствору добавляют 5-ный раствор ПЭГ-6000. Данная концентрация подбиралась опытным путем и оказалась наиболее результативной среди испытанных растворов ПЭГ-6000 с концентрацией 0,2-15 Усиление прочности и скорости сцепления первичных антител с выявляемыми антигенами обеспечивается за счет увеличения вязкости раствора первичных антител при добавлении к ним раствора ПЭГ-6000, что приводит к увеличению чувствительности иммунной реакции. Инкубация срезов осуществляется в течение 30 мин при 37^oC.

5. Инкубация гистологических срезов вторичными антителами в разведении 10 мкг/мл ЗФР на 30 мин.

6. Обработка срезов комплексом авидин-пероксидаза в концентрации 25 мкг/мл в течение 30 мин.

7. Проявление пероксидазной активности 3,3"-диаминобензидина тетрахлоридом (ДАБ) в ЗФР при соотношении 500 мкг ДАБ на 1 мл ЗФР. К свежеприготовленному раствору прибавляют 0,03-ную перекись водорода и срезы инкубируют с субстратом в течение 10 мин. Реакцию останавливают погружением срезов в дистиллированную воду. В дальнейшем срезы докрашивают гематоксидином в течение 3 мин, проводят по спиртам восходящей концентрации и трем порциям о-ксилола, заключают в канадский бальзам.

При осуществлении иммуногистохимического метода всякий раз обязательно используют "положительный контроль", то есть срезы аналогичной исследуемой ткани с заведомо позитивной реакцией. В качестве положительного контроля в данном случае используются гистологические срезы без добавления ПЭГ-6000. Кроме того, используют "отрицательный контроль", то есть срезы аналогичной ткани, в которых опускаются 4 или 5 этапы реакции с целью обнаружения возможного фонового окрашивания. Другими словами это тест на качество забивки эндогенной пероксидазы.

Результаты предлагаемого способа представляли собой увеличение чувствительности метода, что проявлялось более интенсивным и детальным прокрашиванием искомых структур в гистологических препаратах, достигающим 30 по сравнению с "положительным контролем".

Пример 1. Иммуногистохимическая детекция альфа₂-макроглобулина в ткани рака молочной железы.

Фрагменты операционного материала рака молочной железы фиксируют 15-ным водным нейтральным раствором формалина в течение суток при комнатной температуре. В последующем материал подвергают парафиновой проводке, заключающейся в проведении его по батарее, включающей ряд жидкостей: о-ксилол 30 мин, две порции 70^o и 80^o этанола по 6 ч в каждой; три порции 96^o этанола по 6 ч в каждой; абсолютный спирт 30 мин; абсолютный спирт-ксилол в равных соотношениях в течение 2 ч; ксилол-парафин в равных соотношениях при температуре 37^oC 2 ч; три порции парафина при 58^oC по одному часу в каждой. Последняя порция парафина отличается от первых двух тем, что на 500 г его внесено 30 г пчелиного воска. Пропитанные парафином кусочки охлаждают на воздухе, наклеивают на деревянные блоки. Гистологические срезы толщиной 5-8 мкм готовят с помощью микротома. Депарафинирование гистологических срезов проводят обработкой их в трех порциях о-ксилола по 5 мин в каждой и последующим прогреванием срезов в термостате при 58^oC в течение 5 мин. Обезвоживание гистологических срезов достигают обработкой их в четырех порциях этанола (абсолютный, 96^o, 70^o и 56^o) по 3 мин в каждой. Далее срезы переводят на 5 мин в 0,05 М ЗФР pH 7,6. Блокирование эндогенной пероксидазы (этот и последующие этапы проводят в чашках Петри) осуществляют свежим 3-ным раствором перекиси водорода. Длительность этапа 10 мин. ЗФР 5 мин. Далее выдерживают срезы под каплей 5-ного раствора лошадиного сывороточного альбумина (50 мг альбумина в 1 мл ЗФР). После этого избыток альбумина стряхивают и аккуратно обтирают предметные стекла вокруг среза. На последний наносят каплю афинно очищенных кроличьих первичных антител против альфа₂-макроглобулина в концентрации 8 мкг/мл ЗФР. Раствор антител включает 3 альбумина и 0,01 азида натрия. С целью увеличения вязкости раствора добавляют ПЭГ-6000 до конечной его концентрации в растворе 5 Инкубацию срезов проводят в течение 30 мин при 37^oC в чашках Петри с созданием условий влажной камеры (на дно чашки укладывают фильтровальную бумагу, смоченную ЗФР). Две порции ЗФР по 5 мин в каждой, после чего ЗФР меняют. Инкубируют гистологические срезы во вторичных биотилинированных антителах в разведении 10 мкг на 1 мл ЗФР в течение 30 мин. ЗФР 5 мин. Обрабатывают срезы комплексом авидин-пероксидаза ("Пептос", Москва) в течение 30 мин. Непосредственно перед применением комплекс разводят в 200 раз в ЗФР. ЗФР 5 мин. Иммунологическое проявление осуществляют в 0,03-ном растворе субстрата в течение 10 мин. Раствор получают смешивая непосредственно перед использованием 1 мг ДАБ ("Sigma", США) с 2 мл ЗФР и 0,2 мл 0,3 -ной перекиси водорода. Реакцию останавливают споласкиванием срезов в двух порциях дистиллированной воды.

Учитывая, что полученные темно-коричневые преципитаты ДАБ нерастворимы в воде, спирте, ксилоле осуществляют окраску ядер клеток гематоксилином Майера в течение 3 мин. Далее срезы проводят через свежие спирты восходящей концентрации (56^o, 70^o, 96^o и абсолютный этанол) и три ксилола путем тщательного споласкивания в каждой жидкости, затем срезы заключают в бальзам.

Результат читают под разными увеличениями светового микроскопа по наличию золотисто-коричневого окрашивания изучаемого белка в опытных микропрепаратах и "положительном контроле", при отсутствии окраски в "отрицательном контроле". Использование 5-ного ПЭГ-6000 на уровне первичных антител увеличивает чувствительность метода на 25 по сравнению с "положительным контролем". Это проявляется большей интенсивностью окраски белка в опытных микропрепаратах, достигающей в основном темно-коричневого цвета. Повышение иммунопероксидазной детекции исследуемого белка расширяет диагностические возможности исследователя-патологоанатома, за счет чего улучшается диагностика злокачественных опухолей, в частности рака молочной железы.

Пример 2. Иммуногистохимическая детекция ассоциированного с беременностью альфа₂-гликопротеина в ткани рака молочной железы.

Для реакции использовались гистологические срезы операционного материала рака молочной железы, полученные согласно описанной в примере 1 схеме. Отличий было два. Прежде всего использовались афинно очищенные кроличьи первичные антитела против ассоциированного с беременностью альфа₂-гликопротеина. Последний так же, как и альфа₂-макроглобулин является представителем семейства макроглобулинов и тоже является ингибитором протеиназ. Во-вторых, на заключительном этапе иммуногистохимической реакции осуществлялось контрастирование гистологических срезов солями кобальта, которые добавлялись в приготовленный раствор субстрата, как описано выше (см. пример 1). Для приготовления раствора брали 0,04 мл 1-ного водного раствора хлорида кобальта на 2 мл свежеприготовленного раствора ДАБ. Срезы обрабатывались в течение 10 мин, после чего реакция останавливалась споласкиванием их в дистиллированной воде. Далее следовали этапы заключения срезов и их микроскопия.

Исследование готовых микропрепаратов показало увеличение чувствительности метода, проявляющееся большей на 30 против "положительного контроля" интенсивностью и детализацией структур искомого белка в опытных препаратах. Увеличение чувствительности метода реализовалось в улучшении диагностики злокачественной опухоли в гистологических срезах биоптатов или операционного материала рака молочной железы.