сшитый поливиниловый спирт с иммобилизованной м- аминофенилбороновой кислотой в качестве сорбента для аффинного определения гликозилированного гемоглобина

Формула изобретения

Сшитый поливиниловый спирт с иммобилизованной М-аминофенилбороновой кислотой формулы



где количество м-аминофенилбороновой кислоты в сорбенте составляет 0,37

1,49% молекулярная масса активной цепи сшитого поливинилового спирта 210³ 310³, коэффициент набухания равен 80 100, в качестве сорбента для аффинного определения гликозилированного гемоглобина.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к химии полимеров, может быть использовано в медицине для диагностики и оценки тяжести течения сахарного диабета, конкретно к сшитому поливиниловому спирту (ПВС) с иммобилизованной м-аминофенилбороновой кислоты (м-АФБК) общей формулы



в качестве сорбента для аффинного определения гликозилированного гемоглобина, где количество м-АФБК в сорбенте составляет от 0,37 до 1,49% молекулярная масса активной цепи (Мс) сшитого ПВС равна 210³ -310³, коэффициент набухания (q_2m) равен 80-100.

Указанное соединение и его свойства в литературе не описаны.

Известен сорбент аналогичного строения гель полиметакриловой кислоты с иммобилизованной м-аминофенилбороновой кислотой (м-АФБК) общей формулы



который используется для разделения олиго- и полирибонуклеотидов [1]

Известен сорбент аналогичного назначения агароза с иммобилизованной м-АФБК, который используется за рубежом для определения гликозилированного гемоглобина [2] Емкость агароза по лиганду составляет 5-15 мкМ м-АФБК на 1 мл сорбента.

Недостатком сорбента на основе агароза является то, что кратность использования одной порции сорбента ограничивается 3-6 циклами. Это дорогостоящий сорбент [3]

В заявленном техническом решении впервые предложено использовать в качестве сорбента для аффинного определения гликозилированного гемоглобина сшитый поливиниловый спирт (ПВС) с иммобилизованной м-аминофенилбороновой кислотой, где количество м-аминофенилбороновой кислоты в сорбенте составляет от 0,37 до 1,49% молекулярная масса активной цепи сшитого ПВС Мс 210³ 310³, коэффициент набухания q_2m равен 80 -100. Общей формулы



Химические реакции связывания полимера с м-АФБК:



Анализ разностного ИК-спектра сорбента, снятого в таблетках KBr, показал, что связывание лиганда с носителем происходит в результате взаимодействия аминогруппы м-АФБК с активированными соседством альдегидной группы двойными связями полимера, что подтверждается пояснением полос поглощения в области 708, 792, 860, 3000-3040 см^-1 (CH-ароматического кольца); 1308, 1580, 3450 см^-1 (Ar-NH-R); 3625, 3680 см^-1 (B(OH)₂). Определен элементарный состав сорбента. Вычислено, C 59,26; H 6,53; B 3,88. Найдено, C 58,76; H 6,87; B 0,12.

Подтверждением протекания химической реакции между органической молекулой и полимером с образованием модифицированного сорбента могут служить данные термогравиметрического анализа (ТГА). По данным динамического ТГА (на воздухе) химическое связывание м-АФБК со сшитым ПВС приводит к повышению температуры начала разложения модифицированного ПВС (245^oC) по сравнению с исходным (210^oC). Это может быть вызвано ингибирующим действием -CH-NH-PhB(OH)₂ фрагментов полимерной сетки в условиях термоокислительной деструкции.

Согласно заявленному сшитый ПВС с иммобилизованной м-АФБК получают в условиях известного метода [4] Поливиниловый спирт подвергают окислению периодатом натрия по 1,3-гликольным группам, в результате чего образуются альдегиды, которые ацетилируют оставшиеся гидроксильные группы полимера. Последующее дополнительное ацеталирование тримером глутарового альдегида (OHC-(CH₂)₃-CH= приводит к образованию сшитого полимера, содержащего цепочку с активированными соседством с альдегидными группами двойными связями [5] В указанных условиях получено три параллельных образца сшитого полимера с характеристиками:

I q_2m 100, Mc 3,010³

II q_2m 90, Mc 2,610³

III q_2m 80, Mc 2,010³

Химическое связывание каждого из 3 образцов сшитого ПВС с м-АФБК, взятой в концентрациях 12-28 мг/мл, протекает по двойным связям полимера. Затем альдегидные группы полимера закрывают моноэтаноламином, а образовавшиеся азометиновые связи восстанавливают боргидридом натрия. Получают сорбент с содержанием бора по данным элементного анализа от 0,03 до 0,12% что соответствует количеству иммобилизованной м-АФБК от 0,37 до 1,49%

Выход за нижний предел (ниже 0,37%) количества м-АФБК в сорбенте ведет к уменьшению емкости сорбента по лиганду и соответственно к снижению кратности его использования. Выход за верхний предел (выше 1,49%) количеству м-АФБК в сорбенте нецелесообразен ввиду достижения максимальной (20) кратности использования сорбента притаффинном определении гликозилированного сорбента.

Сущность изобретения подтверждается примерами.

Пример 1. Получение сорбента.

Раствор поливинилового спирта в воде окисляют периодатом натрия в концентрации 5-7 мг/мл по 1,2-гликольным группам до альдегидов с последующей сшивкой за счет реакции ацеталирования остаточных гидроксильных групп ПВС образовавшимися альдегидными группами при pH 1,0, температуре 37^oC в течение 48 час. Полученный блок размельчают и дополнительно ацеталируют 5%-ным раствором тримера глютарового альдегида в тех же условиях. Затем сорбент отмывают дистиллированной водой до отрицательной реакции на альдегиды. Далее 10 см³ сорбент промывают 20 мл 0,1 М карбонатного буфера pH 9,6 и добавляют 20 мл раствора м-АФБК (20 мг/мл) на том же буфере. Связывание проводят 18 час при комнатной температуре. После этого альдегидные группы закрывают 0,1М моноэтаноламином (pH 8,0) в течение 4 час, а образовавшиеся азометиновые связи восстанавливают раствором боргидрида натрия (1 мг/мл, pH 7,5-8,0) в течение 2 часов.

Полученный сорбент отмывают сначала 0,1М HCl, затем водой и снова 0,001М HCl до отсутствия в промывных водах м-АФБК (по отсутствию поглощения при 280 нм). Содержание бора по данным элементного анализа в полимере составляют 0,12% что соответствует содержанию м-АФБК 1,49%

По аналогии с примером 1 выполнены примеры с 2 по 9 (см. табл. 1).

Пример 10. Определение гликозилированного гемоглобина.

Для определения гликозилированного гемоглобина сорбент, полученный в условиях примера 1 (1 см³), помещают в колонку, отмывают водой и стартовым буфером (0,025М натрийфосфатный буфер, pH 9,0). Гемозилат готовят путем добавления к 1 объему предварительно отмытых эритроцитов 3 объемов 0,02% раствора азида натрия. Перед тестированием гемолизаты разводят в 3 раза стартовым буфером. На сорбент наносят 1 мл гемолизата. После вхождения гемолизата в колонку ток буфера останавливают на 15 минут, затем промывают колонку стартовым буфером (1 пик). Гликолизированный гемоглобин элюируют элюирующим буфером (200 мМ сорбит, 100 мМ 2-амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол pH 8,5) пик N 2. Определяют оптическую плотность фракций при 414 нм. Содержание гликозилированного гемоглобина определяют по формуле:



где гГб гликозилированный гемоглобин;

Л(1) и Л(2) объем фракций N 1 и N 2 в мл соответственно;

ОП₄₁₄(1) и ОП₄₁₄(2) оптическая плотность при 414 нм фракций N 1 и N 2 соответственно.

Полученный сорбент использовали для определения гликозилированного гемоглобина в крови здорового пациента и больного сахарным диабетом. Каждый образец тестировали 4 раза. По данным таблицы 2 можно судить о достаточно высокой точности определения процента гликозилированного гемоглобина, колебания значений не превышают 1-1,7%

С сорбентом, полученным в условиях примера 1, приведены исследования по установлению кратности использования при аффинном определении гликозилированного гемоглобина (см. табл. 3).

Сорбент остается стабильным при использовании одной порции его более чем в 20 циклах, далее наблюдается резкое уменьшение процента гликозилированного гемоглобина, что демонстрируется данными табл. 3.

Технико-экономические преимущества изобретения.

Заявленный сорбент на основе сшитого поливинилового спирта с иммобилизованной м-аминофенилбороновой кислотой обеспечивает более 20-кратное использование одной его порции при аффинном определении гликозилированного гемоглобина, в то время как одна порция известного сорбента агарозы - используется не более 5-6 раз. Заявленный сорбент дешевле известного в 320 раз.