способ получения посевного материала для производства лимонной кислоты

Формула изобретения

Способ получения посевного материала для производства лимонной кислоты путем выращивания спор гриба Aspergillus niger продуцента лимонной кислоты на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм Aspergillus niger ВКПМ F-710.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения посевного материала для производства лимонной кислоты.

Известен способ получения посевного материала для производства лимонной кислоты путем культивирования гриба Aspergillus niger P-1 на твердой питательной среде по SU, а.с. 658677, кл. C 12 K 1/02, 1975.

Полученный таким способом посевной материал имеет длинные конидиеносцы и незначительное количество спор, что свидетельствует о его невысоком качестве.

Наиболее близким аналогом по своей технической сущности является способ получения посевного материала для производства лимонной кислоты, предусматривающий выращивание спор гриба вида A. niger R-3 на питательной среде, содержащей источник углерода, азота, макро- и микроэлементы (SU, а.с. 939549, кл. C 12 P 7/48).

Посевной материал, полученный по изложенному способу, проявляет высокую биохимическую активность при засеве на мелассной среде с низкой первоначальной концентрацией сахара, не более 3% он не адаптирован к высоким первоначальным концентрациям сахара в среде.

Технический результат предлагаемого способа заключается в селекции высокоэффективного штамма-продуцента лимонной кислоты, что обеспечивает увеличение выхода лимонной кислоты.

Результат достигается тем, что в предлагаемом способе получения посевного материала для производства лимонной кислоты, предусматривающем культивирование гриба вида A. niger на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора, макро- и микроэлементов, из вида A. niger используют штамм A. niger 945.

Штамм A. niger 945 был получен в результате селекции путем ступенчатой обработки N-нитрозометилмочевиной и нитронитрометилмочевиной штамма A. niger 228.

Мутантный штамм хранится в коллекции микроорганизмов Государственного научно-исследовательского института биосинтеза белковых веществ (ГосНИИсинтезбелок) под номером 945.

Штамм также депонирован во ВНИИ генетики и имеет коллекционный номер ВКПМ F-710.

Культурально-морфологические признаки. Культурально-морфологические признаки продуцентов лимонной кислоты обычно изучают на двух средах: на среде Чапека-Докса и на сусло-агаре. На среде Чапека-Докса у пятисуточной культуры конидиальные головки округлой формы, в диаметре 200-220 мкм. Стеригмы однослойные, длина 10-15 мкм. Конидии светло-коричневые, круглые, в диаметре 5-10 мкм. Конидиеносцы длиной 2-3 мм.

Гигантская колония A. niger F-710, выращенная на среде Чапека-Докса, при температуре 32^oC, на пятые сутки имеет круглую форму, диаметр колоний 40-50 мм.

У пятисуточной культуры на суслоагаровой питательной среде конидиальные головки округлые, в диаметре 150-220 мкм. Везикулы вытянутой формы. Конидии светло-коричневые, круглые, в диаметре 5-10 мкм. Конидиеносцы 1-3 мм.

Гигантская колония штамма A. niger 945, выращенная на сусло-агаровой питательной среде, на 5-е сут имеет круглую форму, диаметр колонии 40-50 мм. Край колоний ровный. Субстратный мицелий складчатый. Центр колонии выпуклый с резким светло-коричневым спороношением.

Физиолого-биохимические признаки. Штамм хорошо сбраживает мелассу. Выход лимонной кислоты от сахара мелассы составляет 95-100% ИЗ суммы синтезируемых органических кислот количество лимонной кислоты составляет 95-98% Процесс кислотообразования завершается в более короткие сроки, чем у исходного штамма. Биохимическая активность исходного и селекционированного штаммов представлена в табл. 1, из которой видно, что при использовании посевного материала исходного штамма средний выход лимонной кислоты от сахара мелассы составляет 89,92% при использовании посевного материала селекционированного штамма A. niger F-945 средний выход возрастает до 98,25% Отношение культуры к pH и температуре. A. niger ВКПМ F-710 хорошо растет в интервале pH от 1-11 и температуры 20-40^oC. Однако оптимальные величины pH и T накопления посевного материала, синтезирующие максимальное количество лимонной кислоты, лежат в пределах pH 6-7, а температура 30-32^oC.

Отношение к источникам углерода. Штамм ассимилирует глюкозу, сахарозу, фруктозу, мальтозу, гидролизаты растительного сырья, этанол. Усваивает минеральный и органический азот.

Всхожесть спор при суспендировании в растворе мелассы при 32^oC через 8-10 ч составляет 95-99%

Пример 1. Готовят споруляционную среду, содержащую источник углерода, азота и минеральные соли. В качестве источника углерода используют пивное сусло с содержанием СВ 8-9% К жидкой питательной среде, содержащей все указанные компоненты добавляют 2-3% агара. pH среды устанавливают 6,0. Среду засевают спорами гриба штамма A. niger ВКПМ F-710, причем споры смешивают со стерильным активным углем в соотношении 1:1. Культивирование проводят поверхностным способом, при температуре 30-32^oC, в течение 9 с. При культивировании продуцента таким способом получают 1,2 1,5 грамм спор с 1 дм² споруляционной площади.

Пример 2. Посевной материал получили и использованием штамма A. niger 228. Культивирование осуществляли на мелассной питательной среде с первоначальным содержанием сахара (редуцирующих веществ) 3% в колбах на качалке при перемешивании 260 об/мин, при pH 6,0. Температуру в первые 2 сут поддерживали на уровне 32^oC, затем снижали до 30^oC и поддерживали на этом уровне до конца процесса. Продолжительность ферментации 9 суток. Выход лимонной кислоты 93% Доля лимонной кислоты 85% Сумма щавелевой и глюконовой кислот 8%

Пример 3. Посевной материал получили при культивировании штамма A. niger 945 на сусло-агаровой питательной среде в течение 10 дней. Среду для культивирования готовили на основе мелассы с концентрацией сахара в среде 3% Культивирование осуществляли в колбах на качалке при перемешивании 260 об/мин, при pH 6,0. Температуру в первые 2 сут поддерживали на уровне 32^oС, затем снижали до 30^oC. Продолжительность культивирования 7 сут. Мицелий в период культивирования хлопьевидный, содержащий довольно большое количество шарообразных комочков. Гифы тонкие, активно ветвящиеся. Выход лимонной кислоты составил 100% Доля лимонной кислоты 98% а сумма щавелевой и глюконовой - 2%

Таким образом, при использовании посевного материала штамма Aspergillus niger 945 достигается увеличение выхода лимонной кислоты в среднем на 10% массовая доля лимонной кислоты в сумме синтезируемых кислот в среднем возрастает на 15% длительность кислотообразования снижается на 1 2 сут.