штамм гибридных культивируемых клеток животного mus musculus l - продуцент моноклональных антител к а- детерминанте поверхностного антигена вируса гепатита b

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животного Mus musculus L ВСКК(П) N 630Д продуцент моноклональных антител к a-детерминанте поверхностного антигена вируса гепатита B.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при диагностике вируса гепатита В. Гепатит В является тяжелым инфекционным заболеванием человека. HBsAg (поверхностный антиген вируса гепатита В) - основной маркер заболевания, подтверждающий наличие острой или хронической формы инфекции или носительства. Для создания тест-систем для диагностики гепатита В необходимо наличие моноклональных антител к HBsAg.

Ряд авторов [1,5] получили коллекции гибридом, продуцирующих МКА (моноклональные антитела) к HBsAg. Однако, только немногие из штаммов обладают свойствами, необходимыми для штаммов-продуцентов, пригодных в производстве диагностических тест-систем: высокими ростовыми характеристиками, большим выходом антител на мышь в асцитной жидкости, стабильностью продуцируемых антител в растворе с сорбированными на твердой фазе, высокой активностью в реакции антиген-антитело, специфичностью к определенному участку "а" антигенной детерминанты и главное способностью выявлять HBsAg в низких концентрациях [3,4]

Известно, что группоспецифическая а-детерминанта молекулы HBsAg является сложной и содержит несколько сайтов связывания антител [6] Наличие МКА к различным сайтам на а-детерминанте молекулы HBsAg могло бы позволить конструировать диагностикумы по двухсайтному методу, в котором взаимодействие иммуноспецифических реагентов проводится в одну стадию, используя независимость связывания МКА с разными эпитопами. При конструировании тест-систем по двухсайтному методу можно добиваться более высокой чувствительности [3]

Наиболее близкой к заявляемой является гибридома ЖАК-22. Она обладает следующими свойствами: титр асцитной жидкости в ИФА 410⁵, содержание специфических антител 9,7 мг/мл, чувствительность при определении HBsAg и РИА 2 нг/мл, в ИФА 1 нг/мл [1,2]

По сравнению с ЖАК-22 HBSV-1 отличается большим выходом асцитной жидкости на мышь, более высокими титрами асцитной жидкости в ИФА и более высокой чувствительностью при определении HBsAg.

Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующих моноклональные антитела к определенному сайту группоспецифической а-детерминанты HBsAg.

Цель достигается получением коллекции гибридом, продуцирующих МКА к HBsAg (по реакции в ИФА) и состоящей из 50-ти различных клонов. Гибридомы сравниваются по ростовым характеристикам, стабильности продукции антител, прививаемости мышам сингенной линии, объему получаемых асцитных жидкостей, титрам антител асцитных и культуральных жидкостей в разных вариантах ИФА, а также в РПГА и иммунодиффузии. Продуцируемые гибридомами антитела сравнивают также в реакции конкурентного ИФА, что позволяет разделить их на несколько групп конкуренции. Реакция с adw и ayw генноинженерными вариантами HBsAg позволяет определить МКА комплементарные а-детерминанте молекулы HBsAg.

В результате анализа был отобран штамм, комплементарный определенному участку а-детерминанты HBsAg и обладающий хорошими характеристиками штамма-продуцента МКА.

Гибридомы получают слиянием клеток миеломы PЗ-NS1-Ag4-1 со спленоцитами мыши линии BALB/c, иммунизированной HBsAg. Мышь линии BALB/c (самка, 8 недель) иммунизируют внутрибрюшинно HBsAg, выделенным из плазмы сыворотки хронически больных людей, в количестве 20 мкг в 0,5 мл забуференного фосфатом физраствора (ЗФР), содержащего 50% полного адъюванта Фрейда и через 8 недель 200 мкг HBsAg в 0,5 мл ЗФР внутрибрюшинно. Через 3 дня после второй иммунизации клетки селезенки иммунной мыши гибридизируют с клетками миеломы мыши РЗ-NS1-Ag4-1 (соотношение 3: 1) в 1 мл раствора, содержащего 50% полиэтиленгликоля (м.м. 4000 "Merk") и 5% диметилсульфоксида. После гибридизации и отмывки от полиэтиленгликоля клетки высевают в 96-луночные планшеты по 310⁵ клеток на лунку. Для культивирования и селекции гибридов используют среду ДМЕМ (м) с добавлением 10% телячьей эмбриональном сыворотки, 410^-7М аминоптерина, 10^-4M гипоксантина и 1,610^-5M тимидина. Гибриды-продуценты отбирают методом иммуноферментного анализа (ИФА) и дважды клонируют методом лимитирующих разведений.

Продуктивный штамм обозначен HBSV-1.

Штамм депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур 30.11.93 под номером ВСКК/П/630 Д. Штамм депонирован с научным списанием (паспортом).

Штамм характеризуется следующими признаками.

Родословная штамма.

Гибридома получена слиянием клеток миеломы РЗ-NS1-Ag4-1 со спленоцитами мыши линии BALB/c, иммунизированной HBsAg, с помощью полиэтиленгликоля (м.м. 4000). Селекцию гибридов проводили на НАТ среде. Клетки были дважды клонированы, процент позитивных клонов после 2-го клонирования 100% К моменту депонирования число пассажей 40.

Культуральные свойства.

Среда для культивирования среда ДМЕМ с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой, 40 мкг/мл гентамицина при 37^oC и 5% CO₂. Гибридомы культивируются в стеклянных или пластиковых флаконах объемом 0,05-1,5 л в стационарном состоянии, клетки снимаются смесью растворов трипсина (25 мкг/л) и Версена в соотношении 1:2, посевная доза 150 тыс. клеток в мл, кратность пересева 1:4 или 1:5, время субкультивирования 2-3 суток.

Культивирование гибридомы в организме животного.

Гибридома может быть культивирована в организме мышей линии BALB/c, сенсибилизированных внутрибрюшинно за 5-40 дней 0,5 мл пристана или вазелинового масла. Доза клеток при прививке 1-1010⁶. Асцит образуется через 7-18 дней. Гибридома может перевиваться.

Морфологические признаки.

Культура состоит из крупных округлых клеток, сходных по морфологии и размерам с исходной родительской миеломой РЗ-NS1-Ag4-1.

Данные о видовой принадлежности.

Гибридома является мышиной получена слиянием клеток мышиной миеломы и спленоцитов мыши, может культивироваться в организме мыши, секретируемые ею МКА взаимодействуют с антисывороткой к иммуноглобулинам мыши.

Маркерные признаки и методы их оценки.

Гибридома представляет собой монослойно-суспензионную культуру клеток и продуцирует антитела со следующими маркерными признаками-антитела принадлежат к классу IgG1, слабо взаимодействует с белком А золотистого стафилококка (по данным ИФА и аффинной хромотографии), реагируют в ИФА с HBs-антигеном плазматическим, HBs-антигеном генноженерным adw и ayw серотипов, дают положительный ответ в реакции диффузной преципитации в геле, РПГА и в "сэндвич"-варианте ИФА, взаимодействуя одновременно с HBsAg, сорбированном на твердой фазе, и с HBsAg, конъюгированном с пероксидазой и находящемся в растворе.

Данные о контаминации.

Бактерии и грибы не обнаружены, контроль на контаминацию вирусами и микоплазмами не проводился.

Характеристика биосинтеза полезных продуктов.

Секретируемые гибридомой МКА имеют титр около 110^-3 в культуральной жидкости, 110^-6 в асцитной жидкости (по данным ИФА), стабильность продуцирования антител сохраняется на протяжении 40 пассажей в культуре клеток (срок наблюдения).

Способ криоконсервации.

Клетки замораживаются на ростовой среде с 40%-ной фетальной сывороткой теленка и 10%-ным диметилсульфоксидом при минут 70^oC в пенопластовом контейнере с толщиной стенок 1,5см в течение ночи, хранятся в жидком азоте, размораживаются в течение 1-2 мин при 37-40^oC, отмываются от криозащитной среды и культивируются на ростовой среде в стеклянных или пластиковых флаконах; выживаемость клеток при размораживании составляет 70-80% (по окраске трипановым синим).

На чертеже приведены кривые конкуренций клонов ЖАК-22 и HBSV-1: на оси абцисс номер трехкратного разведения конкурента, конкурентом в реакции являются МКА HBSV-1 из культуральной жидкости; меченые антитела МКА HBSV-1 (1) и ЖАК-22 (2).

Приведенные ниже примеры подробно раскрывают сущность изобретения.

Пример 1. Определение специфической активности антител.

HBsAg из плазмы больных людей или генноинженерный avw серотипа сорбируют в лунки полистироловых планшетов из раствора ЗФР, содержащего антиген в концентрации 10 мкг/мл, в течение ночи; неспецифические места связывания на пластике блокируют с помощью 0,1%-ного раствора казеина в ЗФР, проводят титрование культуральной асцитной жидкости с разведения 1/30 с кратностью 3 в блокирующем буфере; время реакции антиген-антитело ночь при комнатной температуре; после отмывки в лунки добавляют антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена [7] После окончания инкубации (1ч и 37^oC) несвязавшиеся продукты реакции отмывают и связавшийся конъюгат определяют количественно по расщеплению субстрата (H₂O₂) в присутствии хромогена ортофенилендиамина. Положительная реакция проявляется коричневым окрашиванием и просчитывается при 492 нм. Титром считаются разведение раствора антител, при котором наблюдалось оптическое поглощение 0,2 о.е./мл при длине волны 492 нм.

При реакции с плазматическим HBsAg титры в культуральной жидкости составляют примерно 10^-3, титры асцитной жидкости составляют примерно 10^-6. Соотношение титров при реакции с HBsAg плазматическим и генноинженерным ayw серотипа 1:3.

Пример 2. Реакция МКА HBSV-1 с разными серотипами HBsAg. При сравнении реакции МКА с разными серотипами генноинженерного HBsAg (adw и ayw) антитела из раствора ЗФР, с концентрацией 10 мкг/мл, сорбируют в лунках полистироловых планшетов, блокируют 0,1%-ным раствором казеина и добавляют adw и ayw варианты генноинженерного HBsAg в блокирующем буфере с концентрацией от 100 до 1,3 нг/мл с кратностью разведений 3. МКА для сорбции очищают с помощью аффинной хроматографии на белке А золотистого стафилококка [8] Реакцию антиген-антитело ведут в течение ночи при комнатной температуре. После отмывки добавляют МКА HBSV-1, конъюгированные с пероксидазой хрена, на 1 ч при 37^oC. Положительную реакцию определяют как описано выше, МКА HBSV-1 реагируют как с adw, так и с avw серотипами генноинженерного HBsAg с соотношением титров 1:1.

Пример 3. Проведение конкурентного ИФА.

Метод основан на конкуренции между мечеными пероксидазой хрена и немечеными МКА при ограниченной концентрации антигена. Конъюганты МКА получают периодатным методом [7] В лунки полистироловых планшетов с сорбированным HBsAg добавляют конкурирующие антитела в серии 3- кратных разведений и инкубируют 2 ч при 43^oC, после чего вносят меченые МКА на 2 ч при 43^oC. Разведение меченых МКА подбирают так, чтобы они в отсутствие конкурента давали в ИФА значение экстинкции на 492 нм 1 о.е./мл. Количество связавшейся метки определяют, как описано выше. Процент конкуренции вычисляют по формуле:



где А величина связывания метки в отсутствие конкурента,

В связывание метки в присутствии немеченного МКА.

Связывание МКА HBSV-1, меченного пероксидазой хрена, с HBsAg подавляется немеченными МКА HBSV-1 и ЖАК-22. Таким образом МКА ЖАК-22 и HBSV-1 относятся к одной группе конкуренции и конкурируют между собой за сайт связывания на молекуле HBsAg.

Пример 4. Определение стабильности МКА в растворах. Стабильность МКА определяют по соотношению титров в ИФА культуральных и асцитных жидкостей после их обработки следующими способами: прогрев при 37^oC в течение 43 ч, прогрев при 60^oC в течение 1 ч, трехкратная заморозка и разморозка. Показано, что при всех методах обработки титры специфических антител, определенные методом ИФА, в культуральной и асцитной жидкости не меняются.

Пример 5. Определение HBsAg в растворах.

МКА HBSV-1, очищенные методом аффинной хроматографии на белке А золотистого стафилококка, конъюгируют с пероксидазой хрена. В лунках полистироловых планшетов сорбируют очищенные МКА HBSV-1 из раствора ЗФР, содержащего МКА в концентрации 10 мкг/мл в течение ночи; места неспецифического связывания блокируют 0,1%-ным раствором казеина в ЗФР, отмывают трижды водой и добавляют HBsAg в серии 3-кратных разведений в концентрации от 100 нг до 0,01нг в объеме 100 мкл и конъюгат МКА HBSV-1 с пероксидазой хрена в разведении 1/1000 в объеме 50 мкл на 3 ч при 43^oC. Реакцию проявляют, как описано выше. Положительной считают реакцию, когда значение экстинкции на 492 нм превышает значение экстинкции для контрольной лунки (без HBsAg) на 0,04 о.е. Метод позволяет определять до 0,3нг/мл HBsAg в растворе.

Штамм отличается от других близких штаммов следующей совокупностью признаков: продуцируемые им МКА реагируют в ИФА со следующими вариантами HBsAg: плазматическим из сыворотки переболевших людей, генноинженерными осповакцинными серотипов adw и ayw; конкурируют за сайт связывания на молекуле HBsAg с МКА ЖАК-22; не связываются с HBsAg, денатурированным 2-меркаптоэтанолом, следовательно, МКА комплементарны конформационному эпитопу на группоспецифической "а" антигенной детерминанте молекулы HBsAg (этот участок а-детерминанты молекулы HBsAg обозначается как А); МКА относятся к 1gG1; могут быть очищены с помощью аффинной хромотографии на белке А золотистого стафилококка с высоким выходом (98%), обладают высокой стабильностью при хранении в растворах и сорбированными на пластике; клетки обладают отличными ростовыми характеристиками, стабильны по продукции МКА (срок наблюдения около 40 пассажей), хорошо прививаются животным и дают большой выход асцитной жидкости на мышь (4-10 мл) с высоким содержанием специфических антител (5-10 мг/мл) и с высокими титрами специфических антител в ИФА (10⁵-10⁶); МКА пригодны для выявления HBsAg в растворах, сыворотке людей и сорбированного на пластике.

Перечисленные свойства позволяют использовать штамм HBSV-1 для производства диагностических тест-систем.

Список литературы:

1. Кущ А.А. Момот А.М. Шумай Е.П. и др.

Получение и характеристика гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к поверхностному антигену вируса гепатита B. Вопросы вирусологии, 1987, N4, с. 448-451.

2. Жданов Е.М. Кущ А.А. Момот А.М. и др.

Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1986, N12, с.37-40.

3. Кущ А.А. Момот А.М. и др.

Сравнение различных тест-систем для радиоиммунологического определения поверхностного антигена вируса гепатита B с использованием моноклональных антител. Вопросы вирусологии, 1987, N5, с. 544-548.

4. Воробьев С.М. Симонов В.И. Кущ А.А.

Использование моноклональных антител для иммуноферментного определения поверхностного антигена вируса гепатита В. Биотехнология, 1987, N6, с. 720-724.

5. Wands J.R. Zurawski V.R.

HIgh affinity monoclonal antibodies to hepatitis B surface antigen, produced by somatio cell hybrids.

Gastroenterology, 1981, v. 80, p. 225-232.

6. Wands et al.

Signature analisis of hepatitis B viral antigen structure: analisis by monoclonal radioimmunoassays.

PNAS USA, 1984, v. 81, p. 2237-2241.

7. Nakane P.K. and Kawaoi,

Histochem. Cytochem. 1974 y. v. 22, p. 1084.

8. Ey P.L. et a1.

Isolation of pure IgG1, IgG2a and IgG2b immunoglobulins from mouse serum using protein A-Sepharose.

Immunochemistry, 1978, v. 15, p. 429-436.