способ удаления эндотоксина из культуральной жидкости штамма фазы i bordetella pertussis

Формула изобретения

Способ удаления эндотоксина из культуральной жидкости штамма фазы I Bordetella pertussis, предусматривающий отделение супернатанта культуральной жидкости, фракционирование его сульфатом аммония, растворение осадка в фосфатном буфере, содержащем NaCl, отделение антигенсодержащего супернатанта центрифугированием, обработку его сульфатом аммония, повторное растворение осадка в том же буфере, диализ полученной смеси с последующим центрифугированием диализата в градиенте плотности сахарозы в течение 10 24 ч, отличающийся тем, что к антигенсодержащему супернатанту добавляют 0,01 - 0,1 ммоль/мл ионов кальция в присутствии избытка ионов фосфора и выдерживат при 4 25^oС в течение 0,3 4,0 ч до образования 0,01 0,1 ммоль/мл кальций фосфатного геля.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве ионов кальция используют ацетат кальция, или хлорид кальция, или нитрат кальция.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что центрифугирование осуществляют в градиенте плотности сахарозы 0 30 мас./мас. при 60000 122000 g.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способу удаления эндотоксина пертузиса, токсоиду пертузиса и способу его получения.

Пертузис представляет собой зарзное инфекционное заболевание, вызываемое Bordetella pertussis, протекающее особенно тяжело у младенцев и детей младшего возраста.

Для предотвращения этого заболевания до настоящего времени использовали вакцины. Однако любая вакцина, полученная с использованием всего микроорганизма B. pertussis, дает интенсивные побочные реакции, например, такие как лихорадка и для преодоления такого недостатка была разработана и используется бесклеточная пертузисная вакцина (вакцина АСР), практически не содержащая эндотоксина (ЕТ), который, главным образом, ответственен за возникновение лихорадки и других побочных реакций, полученная путем выделения антиинфецирующей фракции (на которую в тексте иногда ссылаются, как на защитную фракцию), например такой, как нитевой гемагглитинин (FHA), токсин пертузиса (РТ) и фибрии.

Решающей стадией получения АСР вакцины является отделение эндотоксина (ЕТ) от антиинфецирующей фракции и обычно для этой цели применяют метод сахароза-градиентного центрифугирования (Опубликованный безэкспертный Японский патент N 0047802).

Кроме этого, в качестве метода удаления пирогена известен способ с использованием кальций фосфатного геля (опубликованный Японский патент N 34-2149). Известно также, что гидроксилапатитный гель, стабилизированный вариант кальций фосфатного геля, является эффективным средством для отделения нитевидного гемаглютинина (FHA) от токсина пертузиса (РТ) и что не содержащий эндотоксина (практически не содержащий) нитевидный гемаглютинин может быть отделен от токсина пертузиса хроматографией на гидроксилапатитном геле и последующей очисткой хроматографией по средству и сахароза-градиентном центрифугированием (Jap. Journal of Bacyeriolodu 38, (1), 423. 1983).

Только с помощью сахароза-градиентного центрифугирования можно удалить около 99,995% эндоксина (ЕТ), однако в том случае, когда жидкость, содержащая сырую антиинфекционную фракцию, обогащена эндотоксином (ЕТ), полное отделение защитной фракции от эндотоксина (ЕТ) затруднительно и выход антиинфекционной фракции соответственно невысок. Кроме того, поскольку производительность процесса невелика и операция является дорогостоящей и длительной, такой способ не является удовлетворительным для промышленного использования.

С другой стороны, простая обработка кальций фосфатным гелем обеспечивает невысокую степень удаления эндотоксина порядка 90-99,9% и, поэтому, не пригодна для промышленного применения. На лабораторном уровне можно отделить и очистить нитевидный гемагглютинин (FHA) до практически полного отсутствия эндотоксина при выделении из токсина пертузиса (РТ) путем комбинации методов хроматографии на колонке с гидроксилапатитом, хроматографии по сродству и сахаро-градиентного центрифугирования, однако такой метод не обеспечивает производительности приемлемой для промышленного использования. Кроме этого, рассмотренная технология объективно отличается от изобретения, которое направлено на удаление эндотоксина (ЕТ) из жидкости, содержащей защитную фракцию и эндотоксин (ЕТ).

В отличие от описанного уровня техники мы разработан эффективный способ удаления эндотоксина (ЕТ) и обнаружено, что обработка кальций фосфатным гелем, предшествующая сахароза-градиентному центрифугированию приводит в результате к чистому отделению защитной фракции от эндотоксина (ЕТ) и кроме этого, обеспечивает усовершенствования как по производительности, так и по степени удаления эндотоксина (ЕТ) по сравнению с сахароза-градиентным центрифугированием. За этими открытиями последовали дополнительные исследования, кульминацией которых явилось создание изобретения.

Изобретение относится к (1) способу удаления эндотоксина из жидкости, содержащей антиинфекционную фракцию и эндотоксин штаммов фазы 1 Bordetella pertussis путем зонального центрифугирования, причем такой способ характеризуется тем, что в указанную жидкость вводят ионы кальция в присутствии избытка в результате осадка отбрасывают; (2) способу получения токсоида пертузиса, характеризующемуся тем, что осуществляют детоксификацию жидкости, содержащей антиинфекционную фракцию, полученную по указанному способу, и (3) токсоиду пертузиса, содержание в котором эндотоксина в расчете на 10 мкг протеинового азота не превышает 0,5 кг.

В соответствии с методом удаления эндотоксина пертузиса согласно изобретению отделение антиинфекционной фракции от эндотоксина может быть осуществлено более четко и чисто, в результате чего защитную фракцию легко выделить с улучшенным выходом. Кроме этого, поскольку зональному центрифугированию можно подвергнуть большой объем исходного материала, выход токсоида пертузиса может быть увеличен более чем вдвое, причем эндотоксин может быть удален с высокой эффективностью. В связи с этим следует отметить, что настоящее изобретение является ценным в промышленном отношении.

Кроме этого, содержание эндотоксина в токсоиде пертузиса по изобретению составляет менее одной десятой в традиционном токсоиде, а использование токсоида пертузиса по изобретению позволит осуществить промышленное производство вакцин, такой же иммунологической мощности, что и традиционные вакцины, но пониженной токсичности.

Упомянутая жидкость, содержащая антиинфекционную фракцию и эндотоксин штаммов фазы 1 Bordetella pertussis может представлять собой, например, верхний слой культурного бульона, полученного при выращивании штаммов фазы 1 B. pertussis или его концентрат, причем особенно предпочтительным является концентрат. Культурирование штаммов фазы 1 Bordetella pertussis может проводиться традиционным методом. Так например, микроорганизмы выращивают в бульонной среде (например, в среде Кохен-Вилера или Стайнер-Шолте) при температуре 35-37^oC в течение 5-7 дней. Верхний слой полученного таким образом культурного бульона собирают, например, путем фильтрации или центрифугирования. Такой верхний слой может быть непосредственно или после концентрирования подвергнут следующей стадии обработки с целью удаления эндотоксина. Концентрирование для этой цели может быть осуществлено путем использования известных per se методов высаливания. Так, например, 2-5 кг сульфата аммония добавляют к каждым 10 л верхнего культурного слоя и полученный в результате осадок собирают путем, например, фильтрации или центрифугирования. Такой осадок затем растворяют в соответствующем количестве системы IM хлористого натрия 0,05 М фосфатный буффер и полученный раствор центрифугируют либо обрабатывают каким-либо еще способом с целью отделения верхнего надосадочного слоя.

Удаление эндотоксина согласно изобретению заключается в том, что в жидкость, содержащую антиинфекционную фракцию и эндотоксин штаммов фазы 1 Bordetella pertussis вводят ионы кальция в присутствии избытка ионов фосфата, полученный в результате осадок отбрасывают и маточную жидкость подвергают зональному центрифугированию.

Если в жидкости отсутствуют ионы фосфата, то добавляют фосфатный буфферный раствор, например, 0,05 М фосфатный буффер дополнительный IM хлористого натрия и затем ионы кальция. Поставщиком ионов кальция могут служит такие растворимые соли кальция, как ацетат кальция, хлористый кальций, нитрат кальция и т.п. а также такие нерастворимые соли кальция, как фосфат кальция и т. п. Особенно предпочтительными соединениями являются ацетат кальция и хлористый кальций. Отношение количества ионов фосфата к количеству ионов кальция составляет 1,25-30 эквивалентов, предпочтительно, 1,5-7,5 эквивалентов ионов фосфата к каждому эквиваленту ионов кальция и рекомендуется обеспечить такой режим, чтобы образовывалось 0,01-0,1 миллиэквивалентов/мл, предпочтительно 0,02-0,7 миллиэквивалентов кальций фосфатного геля.

Обычно используют следующую типовую методику. Предполагая, что осадок, полученный фракционным осаждением надосадочного слоя культурного бульона штаммов фазы 1 Bordetella pertussis с использованием сульфата аммония растворяется в смеси 1 М раствора хлористого натрия и 0,05 М фосфатного буффера, ацетат кальция добавляют до конечной концентрации 0,01-1,0 мас./об. предпочтительно 0,2-0,6 мас./об. при pH 6,5-9 и полученной смеси дают постепенно реагировать в температурном интервале 4^oC комнатная температура в течение времени от 20 мин до 2 ч с получением кальций фосфатного геля. После такой реакции полученный в результате осадок удаляют таким известным per se методом, как фильтрация или центрифугирование. Согласно такой методике можно селективно удалить 90-99,9% эндотоксина без заметной потери защитной фракции.

Полуочищенный продукт, полученный выше, далее подвергают зональному центрифугированию, предпочтительно после дополнительного концентрирования высаливанием с помощью аммония (фракционное осаждение).

Метод зонального центрифугирования согласно изобретению может представлять собой сахароза-градиентное центрифугирование, калий тартратное центрифугирование под действием силы тяжести, цезий хлоридное градиентное центрифугирование и т.п. хотя особенно предпочтительным методом является сахароза-градиентное центрифугирование. Обычные условия сахароза-градиентного центрифугирования: градиент плотности: 0-30 мас./мас. R_макс: примерно 60.000 122.000 С; время: примерно 10-24 ч.

В соответствии с изобретением полученную таким образом жидкость, содержащую антиинфекционную фракцию пертузиса, подвергают детоксификации с помощью формальдегида, глутарового альдегида, пировиноградного альдегида и т.п. после чего избыток формальдегида, глутарового альдегида, пировиноградного альдегида или т. п. удаляют такими per se известными методами, как диализ, центрифугирование или ультрафильтрация и т.д. с получением токсоида пертузиса. Рекомендованная методика детоксификации, в соответствии с опубликованным японским патентом N 57-50925, заключается в добавлении формальдегида к пертузис экзотоксин-содержащей жидкости в количестве 0,1-0,6 об. /об. при практическом отсутствии (т.е. не более 10 мМ) основных аминокислот (например, 1-лизина, глицина и т. п.), инкубировании смеси при температуре 32-42^oC в течение 3-14 дней с тем, чтобы вызвать флоккуляцию, разрушении выпавшего хлопьями токсоида с помощью подходящих средств (например, воздействием ультразвука с частотой 10-15 килоциклов) и суспендирование его в соответствующей водной среде (например, М/100 М/250 фосфатном буфферном растворе) с получением токсоидной жидкости.

В соответствии с изобретением в результате может быть получен токсоид пертузиса с содержанием эндотоксина, в расчете на 10 мкг протеинового азота не более 0,5 нг, предпочтительно не более 0,1 нг согласно лизатному тесту. Другими словами степень удаления эндотоксина может быть улучшена до значения не менее 99,9994% при предпочтительно, по крайней мере 99,9998%

Токсоид пертузиса согласно изобретению может быть превращен хорошо известными методами в осажденную пертузисную вакцину или осажденную пертузис-дифтерия-столбнячную тройную вакцину, предназначенную для вакцинации людей.

На фиг. 1 и 2 показаны профили сахароза-градиентного центрирования кальций фосфатной гелевой группы и контрольной группы, соответственно, согласно примеру 1.

Пример. Представленные справочные и рабочие примеры приведены лишь в целях иллюстрации и не ограничивают сферу изобретения.

Свойства штамма Bordetella pertussis Тохама фаза 1, используемого в следующих примерах и справочных примерах описаны, например, в Jnfection and Jmmunitu 6,889(1972). Такой штамм хранится в Национальном институте здоровья, Токио, Япония (NIHJ) и депонирован также в Институте ферментации, Осака, Япония под католожным номером IFO 14073 от 13 августа 1980 г.

Справочный пример 1. Штамм Bordetella pertussis Тохама фазы 1 (IFO 14073) инокулировали на среду Бордета-Генгоу, приготовленную из картофеля, пептона, хлористого натрия, агара и коровей крови и инкубировали при 35^oC в течение 2 дней. Затем отбирали полупрозрачные круговые колонии и одну из них, реагирующую на К агглютининовое антитело, снова распределяли на среде Бордет-Генгоу с целью приготовления посевной культуры. Затем такую посевную культуру трансплантировали в бульонную среду Коген-Вилера и систему инкубировали в течение 1 дня при 35^oC. Полученную в результате бактериальную суспензию добавляли в бульонную среду Стайнера-Шолте до конечной концентрации 1 миллиард клеток/мл и в склянке Рауха в течение 5 дней проводили инкубацию при 35^oC. Выросшие в культурном бульоне клетки собирали и в верхний слой добавляли 20 мас./об. сульфата аммония. После тщательного перемешивания полученную смесь выстаивали при 4^oC. Примерно через 14 дней смесь центрифугировали, верхний слой отбрасывали и собирали осадок. Затем к такому осадку добавляли 1/10 объема, в расчете на собранный раствор, смеси IM хлористого натрия и 0,05 М фосфатного буффера (pH 8,0) и полученную смесь тщательно перемешивали и выстаивали при 4^oC в течение 4 дней. Затем смесь снова центрифугировали и собирали верхний надосадочный слой (экстракт 1). Этот экстракт 1 обогащен защитной фракцией, содержащей нитевидный гемагглютинин (FHA) и токсин пертузиса (РТ), а также эндотоксин, но при этом не содержит клеток.

К аликвотам такого экстракта 1 постепенно добавляли ацетат кальция до конечных концентраций 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 и 1,0 мас./об. и каждую смесь осторожно перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем полученный в результате осадок отфильтровывали с помощью фильтровальной бумаги с образованием верхнего надосадочного слоя. Используя каждый из полученных таким образом надосадочных слоев, определяли титр гемагглютинина (FA), содержание РТ и содержание ЕТ. Полученные результаты представлены в табл. 1. Содержание РТ определяли методом ELISA, а содержание ЕТ определяли лимулус-лизатным методом (набор Маллинкродта), используя в качестве стандарта эндотоксин E.coIi (Дифко 055-В5).

Из табл. 1 следует, что ЕТ можно селективно удалить путем введения в систему соли кальция в присутствии избытка ионов фосфата и отделения полученного осадка. Более того, в результате добавления 0,2-0,6 мас./об. ацетата кальция можно удалить около 99% ЕТ не теряя при этом защитной фракции (НА титр и содержание РТ).

Справочный пример 2. Повторяли методику, описанную в справочном примере 1, за исключением того, что pH устанавливали равным 5,0-10,0 с помощью гидроксида натрия или хлористоводородной кислоты, а количество добавленного ацетата кальция составляло 0,5 мас. /об. Полученные результаты представлены в табл. 2.

Начиная со значения pH 6,0 происходило желатинирование и степень удаления эндотоксина увеличивалась с повышением значения pH. Из табл. 2 следует, что оптимальное значение pH 7-9.

Справочный пример 3. Повторяли методику, описанную в справочном примере 2, за исключением того, что вместо 0,5 мас./об. ацетата кальция использовали 5 мас. /об. гидроксилапатина (ВДН). Полученные результаты представлены в табл. 3.

Из табл. 3 следует, что по сравнению с добавлением ацетата кальция для образования кальций фосфатных гелей внутри раствора, введение гидроксилапатита приводит к менее эффективному удалению эндотоксина и обеспечивает обращение упомянутой выше зависимости от значений pH.

Пример 1. Каждый экстракт 1 (контрольная группа), полученный по методике, описанной в справочном примере 1, и материал, полученный добавлением ацетата кальция к экстракту 1 до конечной концентрации 0,5 мас. /об. и последующей обработкой смеси согласно описанному в справочном примере 1, смешивали с равным объемом насыщенного водного раствора сульфата аммония и полученную смесь выстаивали в течение семи дней при 4^oC. Осажденный сульфатом материал центрифугировали при скорости вращения 10000 об/мин, в течение 20 мин и собирали осадок. Затем добавляли 1/300 об. в расчете на объем раствора смеси IM хлористого натрия и 0,05 М фосфатного буффера (pH 8,0). После тщательного перемешивания смесь подвергали диализу в трубке с использованием в качестве внешней среды IM раствора хлористого натрия (pH 8,0). Диализат подвергали сахароза-градиентному центрифугированию в следующих условиях: градиент плотности сахарозы 1-30 мас./мас. R_макс. 69400 G и время около 18 ч. Загрузка в случае группы кальция фосфатного желатинирования вдвое превышала загрузку контрольной группы. После центрифугирования, в ротор вводили 34 мас./мас. раствор сахарозы с целью осуществления фракционного сбора. В каждой собранной таким образом фракции определяли содержание FHA с помощью методики ELISA и содержание РТ и ЕТ с помощью метода, описанного в справочном примере 1. Полученные результаты представлены на фиг. 1 и 2. На этих фигурах содержания FHA, РТ и ЕТ обозначены символами -0--- и --, соответственно.

Из данных, представленных на фиг. 1 и 2, следует, что несмотря на удвоенные загрузки, группа кальций фосфатного желатинирования обеспечивает более дискретное отделение защитной фракции (FHA, РТ) от эндотоксина, чем это имеет место в контрольной группе.

В каждой из кальций фосфатных и контрольных групп собирали фракции с дефицитом ЕТ и обогащенные FHA и содержание протеинового азота устанавливали равным примерно 50 мкг/мл. К ним добавляли 0,02 мас./об. желатины, 0,05 мас. /об. Твина 80 и 0,4 об./об. формальдегида и полученные смеси инкубировали в течение нескольких дней при 39^oC. Полученную в результате токсоидную жидкость диализировали и определяли в ней содержание ЕТ. Полученные результаты приведены в табл. 4. Содержание ЕТ определяли лимулус-лизатным тестом (набор Вако Пьюэ Кэмикл), используя в качестве стандарта эндотоксин E.coIi. (Дифко 055-В5).

Как следует из данных, представленных в табл. 4, в сравнении с содержанием ЕТ в основной жидкости токсоида пертузиса на вакцинном уровне (содержание протеинового азота 10 мкг/мл), содержание ЕТ в группе кальций фосфатного желатинирования улучшено до величины менее 1/40 от значения в контрольной группе.

Пример 2. В соответствии с оригинальным методом Левина (Рое Левин, Джозеф Л.Стоун, Льюиз Виман: Факторы, оказывающие влияние на эффективность алюминиевой присадки к токсоидам дифтерии и столбняка. J.Jmmunolody 75, 301-307, 1955), каждую из двух партий основной жидкости токсоида пертузиса разбавляли фосфатным буфферным раствором М/250 (pH 7,0) с получением содержания протеинового азота 10 мкг/мл, после чего добавляли хлористый алюминий до конечной концентрации 0,18 мас./об. Полученную смесь тщательно перемешивали и устанавливали pH 7,0 с помощью хлористоводородной кислоты или гидроксида натрия с целью приготовления 0,2 мг/л адсорбированной на алюминии вакцины.

Основные свойства такой вакцины: pH 7,0, пирогенность на кроликах: отрицательная, уменьшение веса мышей: 10 BWDY/мл или менее; увеличение числа лейкоцитов у мышей: 0,5 LPY/мл или менее; чувствительность к гистамину у мышей: 0,8 HSY/мл или менее; мощность токсоида пертузиса: 8 IY/мл или более. Таким образом, обе партии удовлетворяют стандартным значениям, указанным в Стандарте на биологические продукты.