способ получения фрагментов днк, моноклональные антитела 8c1 и 12g1, ингибирующие ферментативную активность днк- полимеразы thermus aquaticus и штаммы гибридных культивируемых клеток mus.musculus l. - продуценты моноклональных антител 8c1 и 12g1.

Формула изобретения

1. Способ получения фрагментов ДНК, включающий инкубирование исходной ДНК с олигонуклеотидным праймером, термофильной ДНК-полимеразой, дезоксинуклеотидтрифосфатами и амплификацию путем повторяющихся температурных циклов, отличающийся тем, что в качестве ДНК-полимеразы используют ДНК-полимеразу Thermus aquaticus, а перед началом процесса в реакционную смесь вводят моноклональные антитела 8С1 или 12G1, ингибирующие ферментативную активность ДНК-полимеразы при температуре ниже 70^oС и высвобождающие ее при совершении первого температурного цикла.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что моноклональные антитела предварительно инкубируют с ДКН-полимеразой в течение не менее 20 мин до введения в контакт с остальными реагентами.

3. Моноклональные антитела 8С1, характеризующие тем, что продуцируются штаммом гибридных культивируемых клеток Mus.musculus L. ВСКК(П) 643 D, относятся к классу Ig G2, ингибируют ферментативную активность ДНК-полимеразы Thermus aquaticus при температуре ниже 70^oС, обладают константой связывания 1,2 10⁹ л/моль.

4. Моноклональные антитела 12G1, характеризующиеся тем, что продуцируются штаммом гибридных культивируемых клеток Mus.musculus L. ВСКК(П) 645 D, относятся к классу Ig G1, ингибируют ферментативную активность ДНК-полимеразы Thermus aquaticus при температуре ниже 70^oС, обладают константной связывания 2,7 10⁸ л/моль.

5. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus L. ВСКК(П) 643 D, используемый как продуцент моноклональных антител по п.3.

6. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus L. ВСКК(П) 645 D, используемый как продуцент моноклональных антител по п.4.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам и материалам, используемым в генной инженерии.

В настоящее время широкое распространение получил метод амплификации фрагментов дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК), называемый "полимеразная цепная реакция" (ПЦР). Метод заключается в использовании повторяющихся циклов денатурации двойной спирали ДНК, сплавлении (отжиге) специфического олигонуклеотида (праймера) с одноцепочечным участком ДНК и присоединении нуклеотидов к 3"концу праймера (рост цепи) под действием ДНК-полимеразы (Пат. США N463195; Saiki R.K. et. al. Science 230, 1985, 1350-1954)

Пара праймеров выбирается таким образом, чтобы цепь ДНК, синтезированная с одного праймера, содержала место связывания для другого и таким образом была бы матрицей для синтеза нового фрагмента молекулы ДНК.

Процесс амплификации приводит к экспоненциальному росту количества специфических фрагментов ДНК, длина которых определяется расстоянием между 5"концами олигонуклеотидных праймеров, когда они специфически связались с ДНК.

Метод позволяет получить значительные количества фрагментов ДНК из следовых количеств исходного материала, однако наряду с синтезом специфических продуктов может образовываться значительное количество неспецифичных продуктов полимеризации, в том числе праймер-димерных фрагментов.

Основной причиной появления неспецифических продуктов реакции является то, что ДНК-полимераза начинает вести реакцию синтеза ДНК с олигонуклеотидных затравок сразу после смешивания всех компонентов реакционной смеси, что происходит при температурах намного ниже, чем 55-60^oC. При этих температурах может происходить неспецифическое связывание праймеров с матрицей или с друг другом, а затем их удлинение. Для подавления неспецифического синтеза ДНК при низких температурах, при приготовлении реакционной смеси из нее исключают один из необходимых компонентов реакции ПЦР (ДНК-полимеразу, праймеры, матричную ДНК или дезоксинуклеотидтрифосфаты) и добавляют его в смесь после достижения температуры 55-60^oC, такой метод называется "горячий старт".

Метод, получивший название "горячий старт" (МГС), заключается в добавлении критического компонента (без которого реакция полимеризации не может идти) в реакционную смесь в определенный момент (Faloona F et. al. Abst. 1019, 6-th Int. Conf. Aids, 1990, S.Francisco, USA; D"Aquilla R.T. et. al. Nucl. Acids Res. 19, 1991, p. 3749).

Метод позволяет повысить селективность амплификации, но вызывает дополнительные технологические проблемы.

Недостатком метода "горячего старта" (добавление критического компонента при высокой температуре) является вероятность "перекрестного загрязнения" во время открывания реакционных пробирок, что ведет в конечном итоге к снижению селективного процесса.

Наиболее близким по достигаемому результату к заявляемому способу (прототипом) является МГС, заключающийся в помещении в реакционную пробирку восковой перегородки, изолирующей компоненты реакционной смеси друг от друга при температурах ниже температуры плавления воска (примерно 55-60^oC). При достижении требуемой температуры восковая перегородка плавится и все компоненты, необходимые для реакции ПЦР, смешиваются между собой (Chouq et al. Nucl. Acids Res. 20, 1992, 1717-1723).

Недостатками способа являются сложная технология, относительно невысокий выход конечного продукта, что требует большого количества циклов амплификации.

Задачей, стоявшей перед авторами, являлось создание простого и экономичного метода, позволяющего повысить селективность ПЦР, а также выход специфического продукта при небольшом количестве циклов процесса амплификации.

Указанная цель достигается введением в реакционную смесь компонентов, способных ингибировать полимеризующую активность ДНК-полимеразы Thermus aquaticus при температурах ниже 70^oC. В качестве таких компонентов используются моноклональные антитела 8С1 или 12G1, продуцируемые гибридомными штаммами 8C1 и 12G1 соответственно. Штаммы 8С1 и 12G1 продукты слияния клеток мышиной миеломы Х.63.Аg8.653 (субклон Р₃O₁) и селезенки мыши BALB/c, иммунизированной ДНК полимеразой Thermus aquaticus по схеме Кармали и Ново (A.Karmali, C. Novo, Biochemie 72, 1990, 369-371). Слияние и клонирование осуществляется по методу Келера и Милстейна (G. Kohler, C. Milstein, Nature, 256, 1975, 495-497). Селекция гибридных клеток проведена с помощью селективной среды ГАТ (гипоксантин аминоптерин тимидин).

Штаммы характеризовались следующими свойствами:

Штамм 8С1

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus L. ATCC N 8C1 продуцент моноклональных антител к ДНК-полимеразе Thermus aquaticus;

продуцирует антитела 8С1, способные связываться с ДНК-полимеразой Thermus aquaticus и ингибировать ее полимеризующую активность;

его получают введением ДНК-полимеразы Thermus aquaticus мышам Mus. musculus линии BALB/c и последующим слиянием клеток их селезенки и миеломы Х.63. Аg8.653 (субклон P₃O₁). Слияние производят с помощью полиэтиленгликоля ПЭГ-1500. Селекцию гибридных клеток проводят с помощью селективной среды ГАТ (гипоксантин аминоптерин тимидин);

его культивируют на питательной среде RPMI-1640 с 20% эмбриональной коровьей сыворотки, 4 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата-Na, 100 IU/мл пенициллина, 100 IU/мл стрептомицина;

его инъецируют внутрибрюшинно по 110⁶ 510⁶ клеток на мышь. Асцитную жидкость отбирают через 10-12 дн при максимальном объеме асцита. Антитела выделяют из асцитной жидкости сульфатным осаждением с последующей хроматографической очисткой на DEAE-TOYOPEARL-650M.

Штамм 12G1

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus L. ATCC N 12G1 продуцент моноклональных антител к ДНК-полимеразе Thermus aquaticus;

он продуцирует антитела 12G1, способные связываться с ДНК-полимеразой Thermus aquaticus и ингибировать ее полимеризующую активность;

его получают введением ДНК-полимеразы Thermus aquaticus мышам Mus. musculus линии BALB/c и последующим слиянием клеток их селезенки и миеломы Х. 63. Аg8.653 (субклон P₃O₁). Слияние производят с помощью полиэтиленгликоля ПЭГ-1500. Селекцию гибридных клеток проводят с помощью селективной среды ГАТ (гипоксантин аминоптерин тимидин);

его культивируют на питательной среде RPMI-1640 с 20% эмбриональной коровьей сыворотки, 4 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата-Na, 100 IU/мл пенициллина, 100 IU/мл стрептомицина.

его инъецируют внутрибрюшинно по 110⁶ 1010⁶ клеток на мышь. Асцитную жидкость отбирают через 10-12 дн при максимальном объеме асцита. Антитела выделяют из асцитной жидкости сульфатным осаждением с последующей хроматографической очисткой на DEAE-TOYOPEARL-650M.

Отбор специфических моноклональных антител: первичный анализ проводился с помощью иммуноферментного теста. Дно лунок полистироловых планшетов покрывают антигеном ДНК-полимеразой Thermus aquaticus, растворенной в 100 мМ карбонатном буфере рН 9,6, инкубируют ночь при +4^oC, отмывают трижды фосфатным буфером, содержащим 0,05 Твин-20, затем наносят культуральную среду, содержащую продукты секреции гибридомных клеток (моноклональные антитела), после инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре планшеты трижды отмывают фосфатным буфером, содержащим 0,05% Твин-20, затем наносят конъюгат антимышиного иммуноглобулина и пероксидазы хрена, через 1 ч планшеты трижды отмывают фосфатным буфером, содержащим 0,05% Твин-20, затем наносят цитратный буфер, содержащий перекись водорода с ортофенилендиамином. Реакцию останавливают 50%-й H₂SO₄.

При положительной реакции появляется желто-коричневое окрашивание. Моноклональные антитела, давшие положительный ответ в иммуноферментном тесте, далее анализировались на предмет их способности блокировать активность ДНК-полимеразы Thermus aquaticus в экспериментах по удлинению М13 сиквенсного праймера на одноцепочечной ДНК фага М13. Сиквенсный 17-членный М13 праймер (5"GTAAAACGACGGCCAGT-3"), радиоактивно меченный [32P]-АТР по стандартной методике, сплавлялся с одноцепочечной ДНК фага М13. Антитела из гибридомного супернатанта концентрировали добавлением равного объема насыщенного сульфата аммония, а затем осадок растворяли в 10 мМ Tris-HCI (рН 8,3) буфере. Полученные антитела смешивали с ДНК-полимеразой Thermus aquaticus и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Комплекс антитело-полимераза вносили в реакционную смесь, которая содержала 50 мМ Tris-HCl (pH 8,3), 7 mM MgCl₂, 150 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, 200 мкМ dАТР, dGTP, dCTP, TTP и комплекс сиквенсный праймер-ДНК, затем смесь инкубировали 30 мин при 41^oC. Реакцию останавливали добавлением ЕДТА до 20мМ.

Результаты реакции анализировали методом электрофореза в 20% полиакриламидном геле с 7М мочевиной, с последующей экспозицией геля на рентгеновскую пленку. В случае, если антитела не были способны ингибировать активность ДНК-полимеразы Thermus aquaticus, наблюдалось удлинение 17-членного праймера на 7 нуклеотидов, а если ингибировали, то праймер оставался неизменной длины после инкубации. Гибридомы, давшие положительный ответ в обоих вышеописанных текстах, были клонированы методом лимитирующих разведений. Штаммы прошли 3 клонирования, позитивных клонов не менее 100%

Стандартные условия культивирования штаммов: среда RPMI-1640 c 20% эмбриональной коровьей сыворотки, 4 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата-Na, 100 IU/мл пенициллина, 100 IU/мл стрептомицина.

Криоконсервация: клетки штамма ресуспендируются в донорской коровьей сыворотке, содержащей 10% диметилсульфоксида (ДМСО), в концентрации 310⁶ клеток/мл, разливают в пластиковые ампулы при +4^oC, помещают в теплоизолирующий материал (пенополиуретан) и переносят в низкотемпературный холодильник при -70^oC на 24 ч, затем клетки переносят в жидкий азот. Возможно программное замораживание со снижением температуры на 1^oC в мин до -40^oC с переносом в жидкий азот. Размораживание быстрое, при +37^oC. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл той же среды, содержащей 20% эмбриональной коровьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон. Жизнеспособность клеток по включению трипанового синего 80%

Для получения препаративных количеств антител клетки штаммов 8С1 и/или 12G1 культивируют в брюшной полости мышей линии BALB/c. За 10 дней до инъекции штаммов мышам внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл пристана. Штаммы инъецируются внутрибрюшинно по 510⁶-1010⁶ клеток на мышь. Асцитную жидкость отбирают через 10-12 дн при максимальном объеме асцита. Выделение моноклональных антител из асцитной жидкости проводят путем преципитации сульфатом натрия и последующей хроматографической очисткой на DEAE-TOYOPEARL-650M.

Основными свойствами моноклональных антител 8С1 являются:

относятся к классу IgG2b;

связывают ДНК-полимеразу, ингибируя ее активность при температуре до 65^oC, и диссоцируют при 70^oC;

продуцируются гибридомой 8С1, депонированной в American Type Cultur Collection USA; ИНЦ РАН, Санкт-Петербург;

имеют константу связывания 1,210⁹ л/моль.

Основными свойствами моноклональных антител 12G1 являются:

относятся к классу IgG1;

связывают ДНК-полимеразу, ингибируя ее активность при температуре до 65^oC, и диссоциируют при 70^oC;

продуцируются гибридомой 12G1, депонированной в American Type Cultur Collection, USA; ИНЦ РАН, Санкт-Петербург;

имеют константу связывания 2,710⁸ л/моль. Указанные штаммы, моноклональные антитела являются частью заявляемого способа, объединены с ним единым изобретательским замыслом и направлены на достижение единой изобретательской цели получения фрагментов ДНК, что позволяет рассматривать указанные изобретения как составные элементы единой группы изобретений. Дополнительными доказательствами единства групп является взаимная заменяемость или совместное использование обоих штаммов или обоих антител для решения поставленной задачи.

Сущность заявляемой группы изобретений иллюстрируется примером конкретного осуществления изобретения.

Наработка моноклональных антител 8С1 и 12G1 в асцитной жидкости.

Клетки клонов 8С1 и 12G1 инъецируют мышам линии BALB/c внутрибрюшинно в дозе 5 и 10 млн. соответственно. За 10 дн до инъекции штаммов мышам внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл пристана. Асцитную жидкость отбирают через 10-12 дн при максимальном объеме асцита. Концентрация антител в асците составляет 10-20 мг/мл.

Очистка моноклональных антител 8С1 и 12G1 из асцитной жидкости.

К одному объему асцитной жидкости, содержащей моноклональные антитела, добавляют капельно 0,9 объема 2,53 М раствора Na₂SO₄ и перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре. Преципитат осаждают при 5000 g в течение 30 мин и затем растворяют в 10мМ фосфатном буфере (рН 8,0). Полученный раствор диализуют дважды против десятикратного объема того же при +4^oC в течение ночи. Раствор антител после диализа наносят на колонку с сорбентом DEAE-TOYOPEARL-650M. После нанесения антител колонку промывают 10мМ фосфатным буфером (2 объема колонки) и затем элюируют сорбированное антитело линейным градиентом фосфатного буфера (10-160мМ). Общий объем элюента 5 л для колонки объемом 250 мл. Фракции, содержащие белок, анализируются в иммуноферментном тесте. Фракции, давшие положительный ответ, концентрируются и подвергаются дальнейшей очистке от нуклеаз с помощью гельфильтрации на BioGel-А 0,5м.

Анализ моноклональных антител в ПЦР-тесте в модельной системе.

ПЦР тест выполнялся с антителами 8С1 на последовательных разведениях ДНК бактериофага в качестве матрицы и в присутствии геномной ДНК человека. Лямбда праймеры длиной 24 основания использовались в тесте, сенс: 5"TCCGGATGCGGAGTCTTATCCGTG-3"; антисенс: 5"-CCTGTTATTAGCTCAGTAATGT-3". Реакция проводилась в объеме 10 мкл с 50 мМ KCl, 10 мМ Tris-HCl (pH 8,3), 2,5mM MgCl₂, 0,1 мкг геномной ДНК человека, 0,25 единиц ДНК-полимеразы Thermus aquaticus (с 132 мкг/мл антител или без них), 200 мкМ dNTP и 1 мкМ каждого (сенс и антисенс) лямбда праймеров. Процесс амплификации проводили в Perkin-Elmer Model 480 DNA Thermal Cycler, 40 циклов, 94^oC 1 мин, 65^oC 1 мин, 72^oC 4 мин, с окончательной достройкой 10 мин при 72^oC. Результаты амплификации анализировались в 12% полиакриламидном геле с последующей окраской бромистым этидием (см. чертеж). ПЦР проводилась при следующих условиях: без (-) и с (+) 1,5 мкг антител 8С1, при этом анализировалось 1000(1,2), 200(3,4), 40(5,6) и 8(7,8) исходных копий ДНК фага l М маркеры молекулярного веса PBR 322/mspl.