способ оценки состояния антиэндотоксинового иммунитета в отношении грамотрицательных бактерий (лпс - тест - ифа)

Формула изобретения

Способ оценки состояния антиэндотоксинового иммунитета в отношении грамотрицательных бактерий путем использования антител к гликолипиду хемотипа Re в иммуноэнзимной реакции, отличающийся тем, что в мазках крови определяют содержание полиморфно-ядерных лейкоцитов, связавших эндотоксин в организме обследуемого, и содержание полиморфно-ядерных лейкоцитов, способных дополнительно связывать эндотоксин при обработке мазков гликолопидом Re in vitro, и состояние антиэндотоксинового иммунитета оценивают как нормальное при нормальном содержании лейкоцитов, связавших эндотоксин в организме обследуемого, и наличии лейкоцитов, способных дополнительно связывать эндотоксин in vitro; как активацию антиэндотоксинового иммунитета на фоне компенсированной эндотоксинемии при повышенном содержании лейкоцитов, связавших эндотоксин в организме обследуемого, и наличии лейкоцитов, способных дополнительно связывать эндотоксин in vitro; как активацию антиэндотоксинового иммунитета на фоне декомпенсированной эндотоксинемии при повышенном содержании лейкоцитов, связавших эндотоксин в организме обследуемого, и отсутствии лейкоцитов, способных дополнительно связывать эндотоксин in vitro; как истощение антиэндотоксинового иммунитета при нормальном содержании лейкоцитов, связавших эндотоксин в организме обследуемого, и отсутствии лейкоцитов, способных дополнительно связывать эндотоксин in vitro; как глубокое угнетение антиэндотоксинового иммунитета при сниженном содержании лейкоцитов, связавших эндотоксин в организме обследуемого, и отсутствии лейкоцитов, способных дополнительно связывать эндотоксин in vitro; как восстановление угнетенного ранее антиэндотоксинового иммунитета при сниженном содержании лейкоцитов, связавших эндотоксин в организме обследуемого, и при наличии лейкоцитов, способных дополнительно связывать энтодотоксин in vitro.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунодиагностике, и может быть использовано для оценки состояния здоровья лиц, подвергавшихся воздействию проникающей радиации, для выявления "групп риска" при диспансеризации, для оценки состояния больных и эффективности лечения заболеваний, вызванных грамотрицательными бактериями.

Все известные способы оценки антиэндотоксинового иммунитета основаны на определении титров антител к гликолипиду хемотипа Re, нейтрализующих эндотоксины различных грамотрицательных бактерий.

Известен, в частности, способ определения в крови антител к гликолипиду хемотипа Re по их способности вызывать агглютинацию эритроцитов, сенсибилизированных Re-гликолипидом, который был выделен из клеток Salmonella minnesota R595 и обработан щелочью /1/. Недостатком этого способа является низкая чувствительность, так как гидролиз щелочью приводит к потере антигенных детерминант, что заметно снижает чувствительность эритроцитарного диагностикума.

Известен также более чувствительный способ определения антител к гликолипиду Re в реакции пассивной гемагглютинации с эритроцитами, которые сенсибилизированы нативным Re-гликолипидом в комплексе с бычьим сывороточным альбумином /2/. Однако этот способ характеризуется отсутствием строгой специфичности реакции, поскольку агглютинацию эритроцитов, сенсибилизированных Re-гликолипидом, могут вызывать не только антитела к Re-гликолипиду, но и другие антитела или белки плазмы крови, реагирующие, например, с декстрансульфатом.

Известен специфический способ выявления антител к гликолипиду Re путем встраивания гликолипида в мембрану липосом, введения специального маркера внутрь липосом, проведения комплементзависимого иммунного лизиса липосом и потенциометрического определения титра антител по выходу маркера /3/. Недостатками способа являются техническая сложность его осуществления в связи со сложностью получения и хранения липосом со встроенным гликолипидным антигеном и внутренним маркером, необходимость использования специальных маркеров и дефицитных фторселективных электродов.

Известен также способ оценки антиэндотоксинового иммунитета путем иммуно-энзимного определения циркулирующих антител к Re-гликолипиду, для выявления которых использовали моноклональные антитела к иммуноглобулинам класса IgG /4/. Способ характеризуется низкой чувствительностью в связи с использованием моноклональных анти IgG-антител, что позволяло выявлять иммуноглобулины лишь у 35% обследованных.

Наиболее близким к предлагаемому является способ оценки антиэндотоксинового иммунитета путем иммуно-энзимного выявления антител к Re-гликолипиду при помощи поликлональных антител к иммуноглобулинам IgG человека /5/. Однако этот способ недостаточно информативен, так как не учитывает клеточные факторы иммунитета, в частности, не учитывает так называемые цитофильные антитела, фиксированные своим Fc-фрагментом на лейкоцитах и макрофагах. Способ также недостаточно чувствителен, так как содержание циркулирующих антител не всегда четко коррелирует с состоянием антиэндотоксинового иммунитета.

Целью изобретения является повышение информативности и чувствительности способа.

Цель достигается тем, что согласно предлагаемого способа оценки иммунитета к эндотоксинам грамотрицательных бактерий путем использования антител к гликолипиду хемотипа Re в мазке крови, обследуемого при помощи иммуно-энзимной реакции, определяют содержание полиморфно-ядерных лейкоцитов, несущих на своей поверхности эндотоксин, связанный клетками в организме обследуемого за счет цитофильных антител, а также содержание полиморфно-ядерных лейкоцитов, способных дополнительно связывать эндотоксин при обработке мазков Re-гликолипидом in vitro.

Состояние антиэндотоксинового иммунитета при этом оценивают следующим образом:

а) как нормальное при нормальном содержании лейкоцитов, связавших эндотоксин в организме обследуемого, и наличии лейкоцитов, способных дополнительно связывать эндотоксин in vitro;

б) как активацию антиэндотоксинового иммунитета на фоне компенсированной эндотоксинемии при повышенном содержании лейкоцитов, связавших эндотоксин в организме обследуемого, и наличии лейкоцитов, способных дополнительно связывать эндотоксин in vitro;

в) как активацию антиэндотоксинового иммунитета на фоне декомпенсированной эндотоксинемии при повышенном содержании лейкоцитов, связавших эндотоксин в организме обследуемого, и отсутствии лейкоцитов, способных дополнительно связывать эндотоксин in vitro;

г) как истощение антиэндотоксинового иммунитета при нормальном содержании лейкоцитов, связавших эндотоксин в организме обследуемого, и отсутствии лейкоцитов, способных дополнительно связывать эндотоксин in vitro;

д) как глубокое угнетение антиэндотоксинового иммунитета при сниженном содержании лейкоцитов, связавших эндотоксин в организме обследуемого, и отсутствии лейкоцитов, способных дополнительно связывать эндотоксин in vitro;

е) как восстановление угнетенного ранее антиэндотоксинового иммунитета - при сниженном содержании лейкоцитов, связавших эндотоксин в организме обследуемого, и при наличии лейкоцитов, способных дополнительно связывать эндотоксин in vitro.

Способ осуществляют следующим образом.

У обследуемого берут кровь из пальца (или вены), готовят два тонких мазка, сушат на воздухе 30 мин, фиксируют в течение 15 мин 96^o этанолом (или метанолом) и отмывают от спирта в течение 5 мин физиологическим раствором. Затем для инактивации эндогенной пероксидазы лейкоцитов на мазки наносят смесь 96^o этилового спирта и 3% перекиси водорода (1 мл спирта и 0,25 мл перекиси на каждый мазок), выдерживают 20 мин и в течение 5 мин отмывают физиологическим раствором. Далее для выявления лейкоцитов, способных связывать эндотоксин in vitro, на мазок N 2 наносят 1 мл гликолипида хемотипа Re в концентрации 40 мкг/мл. Используют гликолипид хемотипа Re производства Научно-производственного центра "Микроэкос", полученный из клеток Salmonella minnesota R595 путем обработки хлороформом и метанолом и переведенный в водорастворимое состояние путем комплексирования с сывороточным альбумином. Мазок N 2 обрабатывают раствором гликолипида в течение 30 мин и затем в течение 5 мин отмывают физиологическим раствором.

Затем оба мазка в течение 30 мин обрабатывают конъюгатом антител к Re-гликолипиду с пероксидазой (1 мл конъюгата на каждый мазок). Применяют конъюгат производства Научно-производственного центра "Микроэкос", полученный путем конъюгирования пероксидазы хрена с фракцией IgG сыворотки кролика, иммунизированного Re-гликолипидом. После обработки конъюгатом мазки в течение 5 мин отмывают физиологическим раствором, после чего на мазки наносят по 1 мл смеси 33% перекиси водорода (субстрат фермента пероксидазы) с ортофенилендиамином (индикаторный краситель) и этанолом. Для приготовления смеси используют 200 мкл раствора ортофенилендиамина (100 мл ортофенилендиамина и 1 мл этилового спирта), 2 мкл 33% перекиси водорода и 200 мл физиологического раствора. Через 30 мин обработки смесью мазки промывают водой, подсушивают на воздухе и для выявления ядер клеток окрашивают в течение 10 мин толуидиновым синим. Для приготовления красителя используют 0,25 г толуидинового синего, 2 мл ледяной уксусной кислоты, 5 мл 96^o этилового спирта и доводят смесь дистиллированной водой до 100 мл. После окрашивания мазки промывают, подсушивают и микроскопируют. При микроскопировании на мазках хорошо видны синие ядра полиморфно-ядерных лейкоцитов. Полиморфно-ядерные лейкоциты, несущие на своей поверхности эндотоксин и связавшие конъюгат антител к Re-гликолипиду с пероксидазой, окрашены в желтоватый цвет. Для определения содержания лейкоцитов, связавших эндотоксин, подсчитывают количество желтоватых лейкоцитов не менее чем из 100 полиморфно-ядерных лейкоцитов и выражают их содержание в процентах. При этом в мазке N 1 определяются только лейкоциты, связавшие эндотоксин в организме обследуемого, а в мазке N 2, кроме них, еще могут быть дополнительно подсчитаны лейкоциты, связавшие эндотоксин in vitro при обработке мазка Re-гликолипидом. Заключение о наличии лейкоцитов, способных дополнительно связывать эндотоксин in vitro, делают в том случае, когда содержание желтоватых лейкоцитов в мазке N 2 значимо (на 2 сигмы) превышает содержание таких лейкоцитов в мазке N 1.

Отклонением показателей содержания лейкоцитов, связавших эндотоксин в организме обследуемого, считали увеличение или снижение показателя по сравнению с нормой на 2 сигмы.

Для определения показателей нормы обследовали 35 практически здоровых лиц в возрасте 25-50 лет. Параллельно у этих же людей определяли титры циркулирующих антител к гликолипиду хемотипа Re в иммуно-энзимной реакции. В лунках полистироловых плашек для иммунологических реакций сорбировали Re-гликолипид в концентрации 40 мкг/мл, затем вносили сыворотки обследуемых в разных разведениях, добавляли конъюгат пероксидазы с протеином A, а затем субстрат для фермента с индикаторным красителем. При этом использовали ингредиенты производства Научно-производственного центра "Микроэкос".

Результаты обследования (табл.1) показали, что в норме количество эндотоксинпозитивных клеток в организме человека не превышает показателя 3,5+0,4 (p<0,01) при довольно значительном содержании лейкоцитов, способных дополнительно связывать эндотоксин, т.е. в норме человек располагает резервами связывания эндотоксина.

Для оценки специфичности предлагаемого способа брали кровь у 5 здоровых людей и готовили по 4 тонких мазка. Мазки NN 1 и 2 обрабатывали как указано выше в соответствии с предлагаемым способом. Мазки NN 3 и 4 сначала обрабатывали так же, однако перед добавлением конъюгата Re-антител с пероксидазой на мазок N 3 наносили 1 мл фракции IgG сыворотки кролика, иммунизированного Re-гликолипидом, но не конъюгированной с ферментом, а на мазок N 4 1 мл фракции IgG сыворотки не иммунизированного кролика, которую для удаления естественных антител к Re-гликолипиду предварительно сорбировали эритроцитами, нагруженными Re-гликолипидом. Мазки выдерживали 30 мин, а затем отмывали физиологическим раствором и далее обрабатывали как мазки NN 1 и 2.

Результаты приведены в табл.2.

Как видно из полученных результатов (табл.2), обработка мазков неконъюгированными с ферментом анти Re-антителами практически полностью подавляет реакцию лейкоцитов, несущих эндотоксин, с антителами к Re-гликолипиду, конъюгированными с пероксидазой, в то время как фракция IgG сыворотки не иммунизированного кролика не влияет на показатели последующей реакции с конъюгатом, Следовательно, в предлагаемом способе антитела к Re-гликолипиду выявляют лейкоциты, несущие на своей поверхности эндотоксин.

Для выяснения механизмов связывания эндотоксина лейкоцитами брали кровь у 3 здоровых людей и готовили по 13 тонких мазков, которые обрабатывали по предлагаемому способу, но с изменениями, указанными в табл.3. Все использованные ингредиенты получены от Научно-производственного центра "Микроэкос".

Как видно из табл.3, обработка мазков сывороткой против Fab фрагментов иммуноглобулинов человека снижала количество лейкоцитов, связавших эндотоксин (мазки NN 3 и 4). Сыворотка против IgG человека также снижала количество лейкоцитов, связавших эндотоксин (мазки NN 5 и 6), однако сыворотка против IgM человека практически не влияла на количество окрашенных лейкоцитов (мазки NN 7 и 8). Предварительная обработка мазков неконъюгированной сывороткой против Re-гликолипида, резко снижала количество окрашенных лейкоцитов (мазок N 9), однако если такой мазок перед добавлением конъюгата обработать Re-гликолипидом, то количество окрашенных лейкоцитов восстанавливается до нормы (мазок N 10). Если перед добавлением Re-гликолипида такие мазки обработать сывороткой Fab фрагментов или сывороткой против IgG человека, то наблюдается снижение количества окрашенных лейкоцитов (мазки NN 11 и 12). Сыворотка против IgM человека такого действия не оказывала.

Ингибирующее действие сывороток против Fab фрагментов иммуноглобулинов человека и против IgG человека показывает, что лейкоциты связывают эндотоксин и в организме человека и in vitro при помощи цитофильных антител класса IgG.

Пример 1. Использование способа для изучения динамики изменений показателей антиэндотоксинового иммунитета у облученных животных.

Обследовали 2 группы белых беспородных мышей весом 18-20 г по 100 животных в каждой. Первую группу облучали гамма-квантами в дозе 600 р при мощности дозы 150 р/мин. Перед облучением через 5, 10, 15, 20, 25 и 30 сут после облучения в каждой группе забивали по 5 мышей, изучали содержание эндотоксинпозитивных лейкоцитов, титры анти Re-антител в иммуно-энзимной реакции и делали количественные высевы на агар Эндо для определения количества энтеробактерий в 1 г стенки тонкой кишки с целью выявления кишечного дисбактериоза.

Результаты представлены в табл.4.

Как видно из табл.4, у облученных животных развивался кишечный дисбактериоз: количество антеробактерий в стенке тонкой кишки через 15 сут после облучения увеличивалось более чем на 3 порядка по сравнению с нормой и даже к последнему сроку наблюдений дисбактериоз, хотя и в меньшей степени, но все еще имел место. Титры антител у облученных животных на протяжении всего периода наблюдений были снижены. В то же время наблюдалась достаточно четко выраженная динамика изменений показателей содержания эндотоксинпозитивных лейкоцитов у облученных животных в разные сроки после облучения.

Для описания этих изменений были применены следующие условные обозначения:

__ нормальное содержание эндотоксинпозитивных лейкоцитов в организме обследуемого;

повышенное содержание эндотоксинпозитивных лейкоцитов в организме обследуемого;

сниженное содержание эндотоксинпозитивных лейкоцитов в организме обследуемого;

+ способность лейкоцитов дополнительно связывать эндотоксин при нагрузке гликолипидом in vitro;

отсутствие способности дополнительно связывать эндотоксин при нагрузке гликолипидом in vitro.

С применением этих обозначений облученные животные по содержанию эндотоксинпозитивных лейкоцитов были разделены на 6 групп:

группа 1 -+ до облучения;

группа 2 + через 5 сут после облучения;

группа 3 через 10 сут после облучения;

группа 4 -- через 15 сут после облучения;

группа 5 через 20 сут после облучения;

группа 6 + через 25 и 30 сут после облучения.

Группа 1 характеризуется нормальным содержанием эндотоксинпозитивных лейкоцитов in vitro и наличием лейкоцитов, способных дополнительно связывать эндотоксин при нагрузке гликолипидом in vitro.

Группа 2 повышенное содержание эндотоксинпозитивных лейкоцитов in vitro, т. е. состояние эндотоксинемии, которую можно считать компенсированной, так как в крови содержатся лейкоциты, способные дополнительно связывать эндотоксин при нагрузке мазков гликолипидом in vitro. В связи с этим группа 2 может характеризоваться состоянием активации антиэндотоксинового иммунитета на фоне компенсированной эндотоксинемии.

Группа 3 повышенное содержание эндотоксинпозитивных лейкоцитов in vitro и отсутствие клеток, способных дополнительно связывать эндотоксин in vitro (активация антиэндотоксинового иммунитета на фоне декомпенсированной эндотоксинемии). Вследствие того, что антиэндотоксиновый иммунитет в этом состоянии уже не может компенсировать полностью эндотоксинемию, начинается истощение антиэндотоксинового иммунитета.

Группа 4 содержание эндотоксинпозитивных лейкоцитов in vitro находится в пределах нормы, однако резервы дополнительного связывания in vitro истощены, т.е. имеет место выраженное истощение антиэндотоксинового иммунитета.

Группа 5 резкое угнетение антиэндотоксинового иммунитета, т.е. низкое содержание эндотоксинпозитивных лейкоцитов in vitro и отсутствие резервов для дополнительного связывания эндотоксина in vitro.

Группа 6 у животных этой группы количество эндотоксинпозитивных лейкоцитов in vitro было сниженным, однако уже имелись резервы дополнительного связывания эндотоксина. Это состояние можно охарактеризовать как восстановление антиэндотоксинового иммунитета.

На чертеже дана схема осуществления предлагаемого способа.

Материалы, приведенные в примере 1, показывают, что предлагаемый способ более информативен и более чувствителен, чем прототип, в котором оценка антиэндотоксинового иммунитета проводится по содержанию циркулирующих анти Re-антител, так как на протяжении всего срока наблюдений титры анти Re-антител у животных после облучения изменялись мало.

Пример 2. Обследовали 100 лиц обоих полов в возрасте от 18 до 45 лет, проживающих в районах, загрязненных радионуклидами вследствие аварии на Чернобыльской АЭС, и 100 лиц того же возрастного диапазона, проживающих в г. Москве.

Результаты обследования приведены в табл.5.

Как видно из представленных в табл. 5 результатов, большинство обследованных людей в зоне с повышенным содержанием радионуклидов (61%) по состоянию антиэндотоксинового иммунитета относится к группам 3, 4 и 5, т.е. к группам с декомпенсированной эндотоксинемией и угнетением антиэндотоксинового иммунитета, в то время как в Москве в эти группы вошел лишь 21% обследуемых.

При анализе анамнестических данных и дополнительных обследованиях установлено, что у лиц, отнесенных к группам 3, 4 и 5, в 70% случаев (58 человек) обнаружены острые и хронические заболевания органов дыхания, пищеварения, выделительной системы, дисбактериозы. Среди других групп такие заболевания обнаружены лишь в 19% случаев. Таким образом, лица с неблагополучным состоянием антиэндотоксинового иммунитета (3-5 группы) должны быть отнесены к так называемым группам риска и должны подвергаться дополнительному обследованию и лечению. Следовательно, предложенный способ можно использовать при проведении диспансеризации и для оценки состояния здоровья облученных людей.

Пример 3. Обследовали 45 больных цереброспинальными бактериальными менингитами. Брали кровь и определяли содержание эндотоксинпозитивных лейкоцитов и титры антител к Re-гликолипиду при поступлении больных в клинику (в период острой эндотоксинемии), через 3 дня после введения антиэндотоксиновой плазмы крови доноров с повышенным содержанием анти Re-антител и перед выпиской.

Результаты приведены в табл.6.

Из полученных результатов (табл.6) видно, что в остром периоде заболевания при поступлении в клинику больные менингитом характеризовались низким содержанием лейкоцитов, связавших эндотоксин в организме обследуемого, и отсутствием резервов дополнительного связывания эндотоксина. Иными словами, больные менингитом при поступлении в клинику относились к 5 группе, которая характеризуется глубоким угнетением антиэндотоксинового иммунитета. Через 3 дня после введения антиэндотоксиновой плазмы показатели содержания эндотоксинпозитивных лейкоцитов восстанавливались практически до нормы. При выписке эти показатели еще увеличивались. У больных, не леченных антиэндотоксиновой плазмой, восстановление показателей происходило медленнее, а продолжительность лечения в клинике была большей (данные не приведены).

Титры анти Re-антител при поступлении больных в клинику также были снижены и восстанавливались практически до значений нормы через 3 дня после введения антиэндотоксиновой плазмы и перед выпиской. Однако различия между показателями титров антител в разные сроки обследования были менее значительными, чем различия между показателями содержания эндотоксинпозитивных лейкоцитов. Кроме того, содержание эндотоксинпозитивных лейкоцитов перед выпиской было значимо (p<0,01) более высоким, чем показатели нормы, в то время как показатели титров анти Re-антител в этот период от нормы не отличались. Показатели содержания эндотоксинпозитивных лейкоцитов перед выпиской также значимо (p<0,01) превышали такие же показатели у больных через 3 дня после введения антиэндотоксиновой плазмы, тогда как показатели титров анти Re-антител в эти сроки значимо не отличались.

Следовательно, показатели содержания эндотоксинпозитивных лейкоцитов могут использованы для оценки состояния больных менингитом и для оценки результатов их лечения, причем этот способ более информативен и более чувствителен, чем способ оценки по титрам циркулирующих анти Re-антител.

Таким образом, предлагаемый способ оценки антиэндотоксинового иммунитета по содержанию лейкоцитов, способных связывать эндотоксин in vivo и in vitro, может быть использован для оценки состояния здоровья лиц, подвергавшихся воздействию проникающей радиации, для выявления "групп риска" при диспансеризации, для оценки состояния больных и оценки эффективности их лечения при заболеваниях, вызванных грамотрицательными бактериями. Этот метод более информативен и более чувствителен, чем способ оценки антиэндотоксинового иммунитета по титрам антител к гликолипиду хемотипа Re в иммуно-энзимной реакции. Предлагаемый способ доступен для широкого применения в медицинской практике.

Литература

1. Johnes M.A. Bruins S.C. Mc Cabe W.R. Immunization with R mutants of Salmonella minnesota. Serological response to lipid A and the LPS of Re mutants. Infection and Immunity, 1977, 17, 1.

2. Котова Т. А. Лиходед В.Г. Поверенный А.М. Саенко А.С. Табачник А.Л. Авт св. N 1017339, кл. A 61 K 39/00, 15.05.83 Би N 18.

3. Власов Г.С. Торчилин В.П. Гремякова Т.А. Лиходед В.Г. Коростелева М. Д. Иванов Н.Н. Авт.св. N 1141336, кл. G 01 N 33/48, БИ N 7, 23.02.85.

4. Nys M. Goassin L. Sozee A. Demonty G. Enzyme-linked immunosorbent assay for immunoglobulin G subclass antibodies specific for enterobacterial Re core glycolipid in healthy individuals and patients infected by gram-negative bacteria. J. Clin. Microbiol. 1988, 26, 857-862.

5. Barclay G. Robin, Scott Boyd B. Writgh Ian H. Changes in anti-endotoxin-IgG antibody and endotoxaemia in three cases of gram-negative septic shock. Circulatory Shock. 1989, 29, 93-106.