способ получения иммуноглобулина для ингибиции имунного ответа

Формула изобретения

Способ получения иммуноглобулина для ингибиции иммунного ответа путем фракционирования плазмы крови человека, отличающийся тем, что из плазмы крови используют плазму, содержащую Н1А специфические аллоантитела в титре не менее 1 32, а фракционирование проводят натрия октаноатом в концентрации 0,35 0,05% при pH 4,15 0,05 с последующей ионообменной хроматографией.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения иммуноглобулина человека.

Интенсивная терапия гематологических больных компонентами крови, например тромбоцитами, часто сопровождается образованием анти-HIA антител, что существенно затрудняет проводимое лечение из-за развития посттрансфузионных реакций негемолитического типа или состояния рефрактерности. Ведется интенсивный поиск способов, позволяющих предотвратить или отсрочить образование анти-HIA антител и, следовательно, повысить безопасность и эффективность применения отдельных препаратов крови. Большие надежды возлагают на идиотипические анти-анти-HIA антитела, принципиальная возможность образования которых показана у лиц, сенсибилизированных к HIA. Снижение образования анти-HIA антител под влиянием пассивного наведения антиидиотипических антител отмечено после введения коммерческих препаратов иммуноглобулина, предположительно содержащих эти анти-антитела. Известно, что коммерческие препараты иммуноглобулина, получаемые традиционным методом фракционирования этанолом, не содержат анти-HIA антитела. Это может происходить, во-первых, за счет нестандартного и низкого содержания антител в исходных сыворотках, объединяемых в производственную загрузку, что приводит к их разведению и взаимному истощению. Во-вторых, метод фракционирования этанолом, являющийся относительно жестким, приводит к частичной денатурации белка и угнетению специфической активности антител.

Целью заявляемого технического решения является получение иммуноглобулина для ингибиции иммунного ответа за счет использования исходного сырья, содержащего анти-HIA антитела, и щадящего метода фракционирования.

Для этого к плазме с титром анти-HIA антител 1 32 добавляют аэросил в конечной концентрации 30 г/л и перемешивают 2 ч при температуре 37^oC. Центрифугируют смесь при + 4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. В условиях комнатного температурного режима центрифугат разводят двойным объемом 0,06 М ацетатного буфера pH 3,8; коррегируют pH смеси 4,150,05; при постоянном перемешивании вводят натрия окатноат до его конечной концентрации в растворе белка 0,350,05% Раствор перемешивают в течение 60 мин и выстаивают при комнатной температуре в течение 18 ч. Затем центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. Полученный центрифугат освобождают от натрия отканоата и концентрируют до 5% белка методом ультрадиафильтрации. Проводят стерилизующую фильтрацию и выстаивают полуфабрикат в течение 1 мес. при +37^oC. После осветляющей фильтрации проводят раствор белка через колонку с ДЕАЕ-целлюлозой, стерильно фильтруют полуфабрикат и разливают препарат во флаконы. Готовый препарат иммуноглобулина имеет титр анти-HIA антител 1 128.

Таким образом, предложенное техническое решение в совокупности с известными признаками позволяет решать новую задачу получения из плазмы крови человека анти-HIA иммуноглобулина, обладающего специфической активностью в той степени, которая необходима для ингибиции иммунного ответа.

Примеры, подтверждающие возможность осуществления способа.

Пример 1. К плазме с титром анти-HIA антител 1 32 добавляют аэросил в конечной концентрации 30 г/л и перемешивают 2 ч при температуре 37^oC. Центрифугируют смесь при + 4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. В условиях комнатного температурного режима центрифугат разводят двойным объемом 0,06 М ацетатного буфера pH 3,8; коррегируют pH смеси до 4,15; при постоянном перемешивании добавляют натрия октаноат до его конечной концентрации в растворе белка 0,35% Раствор перемешивают в течение 60 мин и выстаивают при комнатной температуре в течение 18 ч. Затем центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. Полученный центрифугат освобождают от натрия октаноата и концентрируют до 5% белка методом ультрадиафильтрации. Проводят стерилизующую фильтрацию и выстаивают полуфабрикат в течение одного месяца при +37^oC. После осветляющей фильтрации раствор белка проводят через колонку с ДЕАЕ-целлюлозой, стерильно фильтруют полуфабрикат и разливают препарат во флаконы. Готовый препарат иммуноглобулина имеет титр анти-HIA антител 1 128, электрофоретическую чистоту 98% выход целевого продукта - 2,4 г из одного литра плазмы.

Пример 2. К плазме с титром анти-HIA антител 1 32 добавляют аэросил в конечной концентрации 30 г/л и перемешивают 2 ч при температуре +37^oC. Центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. В условиях комнатного температурного режима центрифугат разводят двойным объемом 0,06 М ацетатного буфера pH 3,8; коррегируют pH смеси до 4,15; при постоянном перемешивании добавляют натрия октаноат до его конечной концентрации в растворе белка 0,30%

Раствор перемешивают в течение 60 мин и выстаивают при комнатной температуре в течение 18 ч. Затем центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. Полученный центрифугат освобождают от натрия октаноата и концентрируют до 5% белка методом ультрадиафильтрации. Проводят стерилизующую фильтрацию и выстаивают полуфабрикат в течение одного месяца при +37^oC. После осветляющей фильтрации раствор белка проводят через колонку с ДЕАЕ-целлюлозой, стерильно фильтруют полуфабрикат и разливают препарат во флаконы. Готовый препарат иммуноглобулина имеет титр анти-HIA антител 1 96, электрофоретическую чистоту 95% выход целевого продукта 2,8 г из одного литра плазмы.

Пример 3. К плазме с титром анти-HIA антител 1 32 добавляют аэросил в конечной концентрации 30 г/л и перемешивают 2 ч при температуре +37^oC. Центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. В условиях комнатного температурного режима центрифугат разводят двойным объемом 0,06 М ацетатного буфера pH 3,8; коррегируют pH смеси до 4,15; при постоянном перемешивании добавляют натрия октаонат до его конечной концентрации в растворе 0,40% Раствор перемешивают в течение 60 мин и выстаивают при комнатной температуре в течение 18 ч. Затем центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. Полученный центрифугат освобождают от натрия октаноата и концентрируют до 5% белка методом ультрадиафильтрации. Проводят стерилизующую фильтрацию и выстаивают полуфабрикат в течение одного месяца при +37^oC. После осветляющей фильтрации проводят раствор белка через колонку с ДЕАЕ-целлюлозой, стерильно фильтруют полуфабрикат и разливают препарат во флаконы. Готовый препарат иммуноглобулина имеет титр анти-HIA антител 1 192, электрофоретическую чистоту 100% выход целевого продукта 2,0 г из одного литра плазмы.

Пример 4. К плазме с титром анти-HIA антител 1 32 добавляют аэросил в конечной концентрации 30 г/л и перемешивают 2 ч при температуре +37^oC. Центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. В условиях комнатного температурного режима центрифугат разводят двойным объемом 0,06 М ацетатного буфера pH 3,8; коррегируют pH смеси до 4,10; при постоянном перемешивании добавляют натрия октаноат до его конечной концентрации в растворе белка 0,35% Раствор перемешивают в течение 60 мин и выстаивают при комнатной температуре в течение 18 ч, затем центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. Полученный центрифугат освобождают от натрия октаноата и концентрируют до 5% белка методом ультрадиафильтрации. Проводят стерилизующую фильтрацию и выстаивают полуфабрикат в течение одного месяца при +37^oC. После осветляющей фильтрации проводят раствор белка через колонку ДЕАЕ-целлюлозы, стерильно фильтруют полуфабрикат и разливают препарат во флаконы. Готовый препарат иммуноглобулина имеет титр анти-HIA антител 1 192, электрофоретическую чистоту 100% выход целевого продукта - 2,1 г из одного литра плазмы.

Пример 5. К плазме с титром анти-HIA антител 1 32 добавляют аэросил в конечной концентрации 30 г/л и перемешивают 2 ч при температуре +37^oC. Центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. В условиях комнатного температурного режима центрифугат разводят двойным объемом 0,06 М ацетатного буфера pH 3,8; коррегируют pH смеси до 4,2; при постоянном перемешивании добавляют натрия октаноат до его конечной концентрации в растворе 0,35% Раствор перемешивают в течение 60 мин и выстаивают при комнатной температуре в течение 18 ч. Затем центрифугируют смесь при +4^o в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. Полученный центрифугат освобождают от натрия октаноата и концентрируют до 5% белка методом ультрадиафильтрации. Проводят стерилизующую фильтрацию и выстаивают полуфабрикат в течение одного месяца при +37^oC. После осветляющей фильтрации проводят раствор белка через колонку с ДЕАЕ-целлюлозой, стерильно фильтруют полуфабрикат и разливают препарат во флаконы. Готовый препарат иммуноглобулина имеет титр анти-HIA антител 1 96, электрофоретическую чистоту 96% выход целевого продукта 2,7 г/л плазмы.

Пример 6. К плазме с титром анти-HIA антител 1 32 добавляют аэросил в конечной концентрации 30 г/л и перемешивают 2 ч при температуре +37^oC. Центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. В условиях комнатного температурного режима центрифугат разводят двойным объемом 0,6 М ацетатного буфера pH 3,8; коррегируют pH смеси до 4,15; при постоянном перемешивании добавляют натрия октаноат до его конечной концентрации в растворе белка 0,20% Раствор перемешивают в течение 60 мин и выстаивают при комнатной температуре в течение 18 ч, затем центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. Полученный центрифугат освобождают от натрия октаноата и концентрируют до 5% белка методом ультрадиафильтрации. Проводят стерилизующую фильтрацию и выстаивают полуфабрикат в течение одного месяца при +37^oC. После осветляющей фильтрации проводят растворы белка через колонку с DEAE-целлюлозой, стерильно фильтруют полуфабрикат и разливают препарат во флаконы. Готовый препарат иммуноглобулина имеет титр анти-HIA антител 1 64, электрофоретическую чистоту 92% выход целевого продукта - 3,2 г из одного литра плазмы.

Пример 7. К плазме с титром анти-HIA антител 1 32 добавляют аэросил в конечной концентрации 30 г/л и перемешивают 2 ч при температуре +37^oC. Центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. В условиях компактного температурного режима центрифугат разводят двойным объемом 0,06 М ацетатного буфера pH 3,8; коррегируют pH смеси до 4,15; при постоянном перемешивании добавляют натрия октаноат до его конечной концентрации в растворе белка 0,50% Раствор перемешивают в течение 60 мин и выстаивают при комнатной температуре в течение 18 ч, затем центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. Полученный центрифугат освобождают от натрия октаноата и концентрируют до 5% белка методом ультрадиафильтрации. Проводят стерилизующую фильтрацию и выстаивают полуфабрикат в течение одного месяца при +37^oC. После осветляющей фильтрации раствор белка проводят через колонку с DEAE-целлюлозой, стерильно фильтруют полуфабрикат и разливают препарат во флаконы. Готовый препарат иммуноглобулина имеет титр-HIA антител 1 192, электрофоретическую чистоту 100% выход целевого продукта 1,7 г из одного литра плазмы.

Пример 8. К плазме с титром анти-HIA антител 1 32 добавляют аэросил в конечной концентрации 30 г/л и перемешивают 2 ч при температуре +37^oC. Центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. В условиях комнатного температурного режима центрифугат разводят двойным объемом 0,06 М ацетатного буфера pH 3,8; коррегируют pH смеси до 4,0; при постоянном перемешивании добавляют натрия октаноат до его конечной концентрации в растворе белка 0,35% Раствор перемешивают в течение 60 мин и выстаивают при комнатной температуре в течение 18 ч, затем центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. Полученный центрифугат освобождают от натрия октаноата и концентрируют до 5% белка методом ультрадиафильтрации. Проводят стерилизующую фильтрацию и выстаивают полуфабрикат в течение одного месяца при +37^oC. После осветляющей фильтрации раствор белка проводят через колонку с DEAE-целлюлозой, стерильно фильтруют полуфабрикат и разливают препарат во флаконы. Готовый препарат иммуноглобулина имеет титр анти-HIA антител 1 192, электрофоретическую чистоту 100% выход целевого продукта - 1,6 г из одного литра плазмы.

Пример 9. К плазме с титром анти-HIA антител 1 32 добавляют аэросил в конечной концентрации 30 г/л и перемешивают 2 ч при температуре +37^oC. Центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. В условиях комнатного температурного режима центрифугат разводят двойным объемом 0,06 М ацетатного буфера pH 3,8, коррегируют pH смеси до 4,3; при постоянном перемешивании добавляют натрия октаноат до его конечной концентрации в растворе белка 0,35% Раствор перемешивают в течение 60 мин и выстаивают при комнатной температуре в течение 18 ч, затем центрифугируют смесь при +4^oC в течение 1 ч при заданном центробежном ускорении 13000₉. Полученный центрифугат освобождают от натрия октаноата и концентрируют до 5% белка методом ультрадиафильтрации. Проводят стерилизующую фильтрацию и выстаивают полуфабрикат в течение одного месяца при +37^oC. После осветляющей фильтрации раствор белка проводят через колонку с DEDA-целлюлозой, стерильно фильтруют полуфабрикат и разливают препарат во флаконы. Готовый препарат иммуноглобулина имеет титр анти-HIA антител 1 64, электрофоретическую чистоту 93% выход целевого продукта - 3,3 г из одного литра плазмы.

Изложенные выше примеры, подтверждающие возможность осуществления способа, иллюстрируют данные таблицы.

Таким образом, полученные данные подтверждают, что только параметры способа, изложенные в примерах 1 5, обеспечивают при минимально требуемом титре анти-HIA антител в плазме (1:32) уровень специфических антител в препарате иммуноглобулина, достаточном для подавления иммунного ответа (1:96 1:192); при оптимальном выходе целевого продукта (2,1-2,8 г/л) и его электрофоретической чистоте 95 100%

Параметры фракционирования плазмы, выходящие за оптимальные пределы предлагаемого способа, не позволяют получать целевой продукт с достаточным уровнем концентрирования анти-HIA антител и электрофоретической чистотой (примеры 6 и 9). Увеличение концентрации натрия октаноата выше 0,4% (пример 7) или снижение концентрации водородных ионов ниже 4,1 (пример 8) позволяет получать препараты с высоким титром анти-HIA антител (1 192) и электрофоретической чистотой 100% однако выход целевого продукта в этих режимах существенно снижен.