способ регистрации пролиферирующей активности лимфоцитов

Формула изобретения

Способ регистрации пролиферирующей активности лимфоцитов, включающий инкубацию лимфоцитов в присутствии меченого дезоксипиримидина с последующим отмыванием не включенной в ДНК лимфоцитов метки и регистрацией уровня ее включения, отличающийся тем, что в качестве метки используют 5-бром-2"-дезоксиуридин, а регистрацию осуществляют под микроскопом по количеству окрашенных ядер лимфоцитов, при этом включенный в ДНК 5-бром-2"-дезоксиуридин выявляют иммуноферментным методом с использованием мышиных моноклональных антител к нему.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и биологии клетки и может быть использовано в иммунологии при изучении функциональной активности лимфоцитов и определении общего иммунного статуса организма.

Известен способ регистрации пролиферирующей активности лимфоцитов в реакции бласттрансформации (Чернушенко Е.В. Когосова Л.С. Иммунологические исследования в клинике. Киев: Здоровъя, 1978. 160 с.), который заключается в том, что после культивирования с митогеном пролиферирующие лимфоциты учитывают микроскопически по количеству образованных ими бластов или бластоподобных форм.

Основным и существенным недостатком этого способа является то, что при регистрации результатов учитываются только бластные формы лимфоцитов, отличающиеся от лимфоцитарных клеток большими размерами, а лимфоциты на ранних стадиях пролиферации не поддаются учету из-за равных размеров. Кроме того, эти результаты недостаточно специфичны. Это обусловлено тем, что отличающиеся по величине бластные клетки зачастую путают с другими клетками, больших по сравнению с обычными лимфоцитами размеров, например моноцитами. Перечисленные недостатки значительно понижают точность результатов.

Наиболее близким по совокупности существенных признаков к заявляемому техническому решению является способ регистрации пролиферирующей активности лимфоцитов при помощи радиоактивной метки (Шютт Х. Реакция бласттрансформации лимфоцитов // Иммунологические методы/ Под ред. Г. Фримеля: Пер. с англ. М. Медицина, 1087. С. 294-302), когда к культивируемым в питательной среде (без тимидина) с митогеном лимфоцитам добавляют специальную метку азотистое основание, меченное изотопом (как правило H³ -тимидин). В процессе культивирования метка включается в ДНК пролиферирующих клеток. После отмывания меченные H³ -тимидином пролиферирующие лимфоциты увеличивают радиоактивность лимфоцитарной взвеси, которую определяют с помощью сцинтилляционного счетчика. Таким образом, о пролиферирующей активности лимфоцитов косвенно судят по индексу стимуляции /ИС/



либо просто по имп/мин стимулированных лимфоцитов.

Существенным недостатком данного способа, помимо необходимости работы с радиоактивным материалом, является неудовлетворяющая задачам исследования специфичность и точность измерения. Даже по данным автора при наличии высококачественного оборудования ошибка измерения составляет 16-18% В значительной степени к неспецифическим результатам приводит и невозможность дифференцированного контроля излучающих клеток. Кроме того, на специфичность результатов оказывает влияние наличие фона, качество отмывки, возможное присутствие примесей, что в конечном итоге значительно сказывается на точности результатов.

Задача, которую решает изобретение, состоит в повышении специфичности и точности регистрации пролиферирующей активности лимфоцитов, что является очень важным моментом при характеристике иммунного статуса организма.

Указанный технический результат достигается тем, что в среду культивирования (без тимидина) лимфоцитов с митогеном в качестве специфической метки вносят производное азотистого основания 5-бром-2"-дезоксиуридин (БДУ), который включается в синтез ДНК пролиферирующих клеток. Для выявления меченных БДУ лимфоцитов их исследуют в иммуноферментном анализе, используя моноклональные антитела к БДУ, в результате чего ядра пролиферирующих лимфоцитов окрашиваются в коричневый цвет. Эти лимфоциты независимо от размеров легко регистрируются под микроскопом. Высокая степень специфичности и точности данного способа достигается 1) возможностью количественного учета непосредственно самих лимфоцитов; 2) четкой визуальной дифференцировкой клеток по окраске ядер; 3) возможностью регистрации пролиферирующих лимфоцитов на всех стадиях пролиферации; 4) конкретным контролем всех исследуемых клеток под микроскопом.

Заявляемое изобретение характеризуется новой совокупностью существенных признаков, не известной заявителю из предшествующего уровня науки и техники. Указанная совокупность признаков находится в причинно-следственной связи с достигаемым техническим результатом и является необходимой и достаточной для решения поставленной медико-социальной задачи.

Сравнение заявляемого технического решения с прототипом показало наличие отличительных от прототипа существенных признаков, а именно: регистрация пролиферирующей активности лимфоцитов по выявлению клеток с включенным в биосинтез производным азотистого основания в иммуноферментном анализе. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию "новизна".

Сравнение существенных признаков заявляемого изобретения с известными аналогами показало, что дифференцированное количественное выявление пролиферирующих лимфоцитов по окраске ядер на самых ранних стадиях пролиферации за счет обнаружения специально вводимой метки (производного азотистого основания) ДНК с помощью моноклональных антител в иммуноферментном методе, является новым шагом в иммунологии. При этом достигаемый технический результат превышает все известные методы. Следовательно, изобретение соответствует критерию "изобретательский уровень".

Предложенный способ является технически осуществимым, т.к. в нем используются известные средства. В способе нет дорогостоящей или вредной для исследователя аппаратуры. Следовательно, он соответствует критерию "промышленная применимость".

Способ осуществляется следующим образом.

Пробы крови по 5 мл, взятые в узкие пробирки с 0,2 мл гепарина и 2 мл 1% -ного раствора желатины отстаивают в течение 2 ч при 20 ^oC. Образовавшийся слой лимфоцитов оттягивают пипеткой и ресуспендируют в 2-3 мл среды Игла. Культуру центрифугируют при 400 g в течение 20 мин. Осадок ресуспендируют в 5 мл среды Игла, содержащей 15-20% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 200 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина. В пробирки с культурой вносят по 20 мкг/мл фитогемагглютинина и инкубируют их при 37 ^oC в течение 3 сут в вертикальном положении.

За сутки до конца инкубации в пробирки с инкубационной смесью вносят 1% 5-бром-2"-дезоксиуридина (БДУ) в качестве специфической метки.

Через 3 сут культивирования культуральную жидкость удаляют, а осадок лимфоцитов ресуспендируют, дважды отмывают, концентрируют в двух каплях раствора Хенкса.

Одну каплю суспензии лимфоцитов вносят в лунку предметного стекла с обозначенными лунками. Излишки суспензии отбирают. Препарат высушивают на воздухе, наносят на него каплю метанола и снова высушивают.

Высушенный препарат обрабатывают 4 М HCl при 37 ^oC (водяная баня) в течение 30 мин, после чего промывают в двух сменах фосфатно-солевого буфера (ФСБ-Т), содержащего 0,15 М NaCl; 0,02 М фосфаты; 5% ЭТС или 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,05 твина-20; pH раствора 7,4.

Наносят на препарат каплю ФСБ-Т с удвоенным содержанием ЭТС или БСА и инкубируют его во влажной камере 20 мин при 20 ^oC, после чего удаляют ФСБ-Т встряхиванием, а излишки жидкости по краям препарата фильтровальной бумагой.

Наносят на препарат каплю 1% раствора (на ФСБ-Т) мышиных моноклональных антител к БДУ и инкубируют его во влажной камере 1 ч при 37 ^oC, после чего препарат промывают в 4-х сменах ФСБ-Т по 1-2 мин. Остатки жидкости удаляют фильтровальной бумагой.

Наносят на препарат каплю 1% раствора (на ФСБ-Т) кроличьих специфических антител к иммуноглобулинам мыши и снова повторяют процесс инкубации и промывания.

Наносят на препарат каплю 1% раствора (на ФСБ-Т) мышиного моноклонального комплекса пероксидаза-антипероксидаза, повторяя процесс инкубации в предыдущем режиме. Промывают препарат в 8 сменах ФСБ-Т, удаляя остатки жидкости фильтровальной бумагой.

На следующем этапе на препарат наносят каплю 1% раствора 3,3"-диаминобензидина (ДАБ; на ФСБ без твина и ЭТС), содержащего 1:1000 перекиси водорода. Препарат инкубируют при 20 ^oC в течение 5-10 мин, контролируя развитие окраски под микроскопом. Реакцию останавливают промыванием препарата в дистиллированной воде.

Результаты учитывают, просматривая препараты под микроскопом. Пролиферирующие лимфоциты имеют коричневые ядра. Ядра непролиферирующих клеток прозрачны. Отрицательным контролем служат клетки, которые не инкубировались с БДУ.

О пролиферирующей активности лимфоцитов судят по индексу пролиферации /ИПЛ/.

Для определения ИПЛ подсчитывают не менее 100 клеток.

В таблице приведены данные, иллюстрирующие уровень пролиферирующей активности лимфоцитов периферической крови у лиц с различной патологией.

Предлагаемый способ отличается высокой степенью точности и специфичности за счет количественного учета пролиферирующих лимфоцитов, их строгой дифференцировки, возможности регистрации клеток на всех стадиях пролиферации. Применение данного способа не требует дорогостоящего и сложного оборудования, а использование предметных стекол с обозначенными при постановке иммуноферментативной реакции сводит до минимума затраты ценных реактивов и препаратов. Кроме того, отсутствие радиоактивных материалов при использовании данного способа практически делает его безопасным и безвредным для лабораторного персонала.