штамм бактерий escherichia coli - продуцент специфического днк-зонда, используемого для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов corynebacterium diphtheriae и комплементарного tox a гену, определяющему синтез дифтерийного токсина

Классы МПК:C12N1/21 модифицированные введением чужеродного генетического материала
C12Q1/68 использующие нуклеиновые кислоты
Автор(ы):, , ,
Патентообладатель(и):Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского
Приоритеты:
подача заявки:
1993-09-23
публикация патента:

Использование: диагностика инфекционных заболеваний методом гибридизации нуклеиновых кислот. Сущность изобретения: получение штамма Escherichia coli C600 r-m-/p Az 219 toxA" - продуцента специфического ДНК-зонда для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae. Штамм обеспечивает высокий выход плазмидной ДНК p Az 219 toxA", которая используется при ДНК-ДНК гибридизации в качестве специфического зонда.

Формула изобретения

Штамм бактерий Escherichia coli N 228/ГИСК им.Л.А.Тарасевича продуцент специфического ДНК-зонда, используемого для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae и комплементарного tox А гену, определяющему синтез дифтерийного токсина.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинской микробиологии.

Известно, что при лабораторной диагностике инфекционных заболеваний применяется метод ДНК-ДНК-гибридизации, заключающийся в определении в исследуемом материале специфических последовательностей нуклеиновых кислот с помощью комплементарных этим последовательностям ДНК зондов [11] Метод ДНК-ДНК гибридизации со специфическими ДНК зондами сокращает время идентификации требовательных микроорганизмов, позволяет обнаруживать патогенные микроорганизмы непосредственно в клиническом материале и снижает себестоимость лабораторной диагностики инфекционных заболеваний.

В зарубежной литературе имеются сведения об использовании нативных и химерных молекул ДНК или их фрагментов, часть которых представляет специфическую для tox+ гена дифтерийного токсина последовательность оснований, в качестве ДНК зондов при научных исследованиях [9 и 10] В нашей стране при конструировании штаммов-продуцентов иммунотоксинов были созданы химерные репликоны, которые были использованы или могли быть использованы как ДНК зонды при идентификации токсигенных штаммов C. diphtheriae [4, 5 и 3] Однако редкие примеры использования химерных репликонов, несущих специфические последовательности гена дифтерийного токсина, в качестве ДНК зондов также не выходили за рамки научных исследований в основном была показана принципиальная возможность использования метода ДНК-ДНК гибридизации для выявления токсигенных штаммов C. diphtheriae [1 и 2] Во всех известных случаях применения нативных и химерных молекул как ДНК зондов не были определены специфические параметры (чувствительность, специфичность, прогностическая значимость положительных и отрицательных результатов) специализированного метода ДНК-ДНК гибридизации для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов C. diphtheriae, что не позволяло широко использовать этот метод, а следовательно те или иные ДНК зонды, при диагностических исследованиях.

Целью изобретения является штамм Escherichia coli C600 r-m- (pAz 219 toxA") продуцент специфического ДНК зонда.

Штамм Escherichia coli C600 r-m- (pAz 219 toxA") депонирован в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов. Справка о депонировании прилагается. Регистрационный номер 228

Получение штамма. Штамм Escherichia coli C600 r-m- (pAz 219 toxA") получен в результате Ca2+ зависимой трансформации бактериальных клеток штамма Escherichia coli C600 thrI leu6 thil supE44 lacVI tonA r-m- штамм бактерий escherichia coli - продуцент специфического   днк-зонда, используемого для дифференциации токсигенных и   нетоксигенных штаммов corynebacterium diphtheriae и   комплементарного tox a гену, определяющему синтез   дифтерийного токсина, патент № 2085581 -F- изолированной ДНК плазмиды pA 219 oxA по незначительно модифицированному методу Mandel и Higa [8] Селекция трансформантов проведена по устойчивости к ампициллину на полноценной питательной среде, содержащей 50 мкг/мл ампициллина; очистка трансформантов - три последовательных субкультивирования на той же среде. Плазмида, выделенная из устойчивых к ампициллину трансформантов имела ту же электрофоретическую подвижность, что и исходная плазмида, тот же электрофоретический рисунок при электрофорезе в агарозном геле Hind III рестриктов и давала положительный гибридизационный сигнал при ДНК-ДНК гибридизации с ДНК токсигенного штамма C. diphtheriae 665.

Характеристика штамма. Штамм Escherichia coli C600 r-m- (pAz219 toxA") имеет следующие характеристики. Штамм растет на полноценной питательной среде, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Штамм растет на минимальной питательной среде, содержащей 10 мкг/мл треонина, 10 мкг/мл лейцина, 1 мкг/мл тиамина и 50 мкг/мл ампициллина. Штамм не ферментирует лактозу. Штамм обеспечивает стабильность молекулы химерного репликона плазмиды pAz219 toxA", высокий выход плазмидной ДНК при выделении ее методом щелочного лизиса и возможность использования изолированной плазмидной ДНК при ДНК-ДНК гибридизации в качестве специфического ДНК зонда и при Ca2+ зависимой трансформации без дополнительной очистки в градиенте хлористого цезия бромистого этидия. Плазмида pAz219 toxA" стабильна в штамме Escherichia coli C600 r-m- (pAz219 toxA") при культивировании его на средах, содержащих 50 мкг/мл ампициллина, и элиминируется из бактериальных клеток этого штамма при культивировании его на средах, не содержащих ампициллин. На плазмиде pAz219 toxA" локализован ген устойчивости к ампициллину. Рестриктаза Hind III расщепляет плазмиду pAz219 toxA" на два фрагмента, меньший из которых в основном представляет специфическую последовательность структурного toxA гена дифтерийного токсина. Тотальный препарат ДНК штамма Escherichia coli C600 r-m- (pAz219 toxA) плазмидная ДНК и меньший по размерам Hind III фрагмент плазмидной ДНК дают положительный гибридизационный сигнал при ДНК-ДНК гибридизации с ДНК токсигенного штамма C. diphtheriae 665.

При выделении ДНК плазмиды pA 219 toxA специфического ДНК зонда для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов C. diphtheriae штамм Escherichia coli C600 r-m- (pAz219 toxA") выращивают в полноценной жидкой питательной среде, содержащей 50 мкг/мл ампициллина, при 37oC в течение 18-20 ч. Бактериальные клетки осаждают и отмывают центрифугированием; плазмидную ДНК выделяют методом щелочного лизиса с последующей обработкой неочищенного препарата плазмидной ДНК хлористым литием (конечная концентрация 3М), рибонуклеазой (конечная концентрация 3М), рибонуклеазой (конечная концентрация 25 мкг/мл), протеиназой T (конечная концентрация 1 мг/мл), депротеинизацией фенолом, смесью фенол-хлороформ и хлороформом (6). Выделенную плазмидную ДНК фенол-хлороформ и хлороформом (6). Выделенную плазмидную ДНК фрагментируют рестриктазой Hind III в соответствии с рекомендациями фирмы изготовителя фермента и тотальный препарат плазмидной ДНК метят радиоактивной меткой методом рассеянной затравки с целью получения специфического радиоактивного ДНК зонда (7).

Параметры (чувствительность, специфичность, прогностические значения положительных и отрицательных результатов), позволяющие использовать при диагностических исследованиях специализированный метод ДНК-ДНК гибридизации для дифференциации токсигенных и нетоксигенных штаммов C. diphtheriae, при котором меченные радиоактивным изотопом препараты ДНК плазмиды pAz 219 toxA". Escherichia coli C600 r-m- применяются как специфический радиоактивный ДНК зонд, были установлены при сравнительной оценке настоящего метода ДНК-ДНК гибридизации и традиционного метода выявления токсигенных штаммов реакции преципитации в агаре. Обоими методами были изучены 134 токсигенных и 125 нетоксигенных штаммов C. diphtheriae, выделенных на территории России, преимущественно во Владимирской и Пензенской областях, за период с 1986 по 1989 гг. При проведении ДНК-ДНК гибридизации бактериальные клетки изучаемых штаммов лизировали лизоцимом (конечная концентрация 2 мг/мл) и додецилсульфатом натрия (конечная концентрация 1%). Лизаты бактериальных клеток последовательно обрабатывали протеиназой T (конечная концентрация 1 мг/мл), ацетатом натрия (конечная концентрация 0,3 M), ДНК переосаждали этиловым спиртом [6] Пробы наносили на найлоновый мембранный фильтр; обработку фильтров, ДНК-ДНК гибридизацию на мембранных фильтрах и авторадиографию проводили по модифицированному методу Бобкова с соавторами [2] Было показано, что при замене в традиционной технологии бактериологического анализа метода преципитации в агаре методом ДНК-ДНК гибридизации параметры характеризующие настоящий метод ДНК-ДНК гибридизации с ДНК зондом pAz219 toxA". Escherichia coli C600 r-m-, а именно чувствительность, специфичность, прогностические значения положительных и отрицательных результатов были соответственно равны 97, 88, 82 и 98% в случае, если слабый гибридизационный сигнал расценивается как положительный, и 97, 98, 98 и 97% в случае, если слабый гибридизационный сигнал расценивается как отрицательный. В отличие от реакции преципитации в агаре, метод ДНК-ДНК гибридизации с ДНК зондом pAz219 toxA". Escherichia coli C600 r-m- позволил выявить штаммы C. diphthnriae с дефектным геном дифтерийного токсина, то есть штаммы не продуцирующие дифтерийный токсин. Таким образом метод ДНК-ДНК гибридизации с ДНК зондом pAz219 toxA". Escherichia coli C600 r-m- может быть использован не только при диагностических исследованиях, но и при наблюдениях за миграцией tox+ гена детерминирующего синтез дифтерийного токсина и/или его фрагмента toxA гена в популяциях C. diphtheriae.

Литература

1. Бобкова М. Р. Маркина С. С. Мазурова И. К. Бобков А. Ф. Гараев М. М. Тезисы докладов I-й Всесоюзной конференции "Молекулярная структура бактериальных токсинов и генетический контроль их биосинтеза" 1-2 октября 1985 г. г. Москва, с.3-4.

2. Бобков А. Ф. Бобкова М. Р. Гараев М. М. Комбарова С. С. Мазурова И. К. Маркина С. С. Авторское свидетельство N 4406330/30-13 от 21 марта 1988 г.

3. Гараев М. М. Бобкова М. Р. Бобков А. Ф. Лукашевич Н. В. Казенкова Е. В. Генетика. 1990, N 6, с. 990-999.

4. Здановский А. Г. Здановская М. В. Зайцев Е. М. Свиридов В. В. Якубович Н. В. Ребентиш Б. А. Янковский Н. К. Молекулярная биология, 1988, т.22, N 5, с. 1293-1300.

5. Ковген А. А. Жданов В. М. ЖМЭИ, 1988, N 8, с. 23-31.

6. Плазмиды под редакцией К. Харди, М. Мир, 1990.

7. Feirberg A.P. Vogelstein B. Anal. Biochem. 1984, v. 137, p. 266-267.

8. Mandel M. Higa A. J. Mol. Biol. 1970, v.53, p.154.

9. Papenheimer A.M. Murphy J.R. The Lancet, 1983, v.2, p.923-926.

10. Rappuoli R. Perugini M. Falsen E. The New England Journal of Medicine, 1988, v.18, p. 12-14.

11. Tenover F.C. Clin. Microbiol. Rev. 1988, v.1, p.82-101.

Класс C12N1/21 модифицированные введением чужеродного генетического материала

рекомбинантный штамм бактерий escherichia coli n41 (pbpun4/mr)-продуцент сайт-специфической эндонуклеазы рестрикции bpun4i -  патент 2529362 (27.09.2014)
рекомбинантная плазмидная днк ppa-oprf-eta, кодирующая синтез рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa, штамм escherichia coli pa-oprf-eta - продуцент рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa и способ получения рекомбинантного белка oprf-eta pseudomonas aeruginosa -  патент 2529359 (27.09.2014)
нуклеиноваяя кислота, обладающая активностью гена фосфатазы фосфатидной кислоты (варианты), белок, рекомбинантный вектор, трансформант и способ получения композиции жирной кислоты -  патент 2528875 (20.09.2014)
слитый белок тиоредоксина и домена 4 инфестина, способ его получения, экспрессионная плазмидная днк, кодирующая слитый белок, и бактерия рода escherichia coli, трансформированная такой плазмидной днк -  патент 2528251 (10.09.2014)
тест-система для скрининга ингибиторов протеинкиназы gsk3 ; человека -  патент 2528059 (10.09.2014)
рекомбинантный штамм бактерий escherichia coli - продуцент янтарной кислоты (варианты) и способ получения янтарной кислоты с использованием этого штамма -  патент 2528056 (10.09.2014)
проникающие в клетку пептиды и полипептиды для клеток микроорганизмов -  патент 2526511 (20.08.2014)
плазмида 40nagal, определяющая синтез -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, штамм e.coli rosetta(de3)/40nagal - продуцент химерного белка, включающего аминокислотную последовательность рекомбинантной -n-ацетилгалактозаминидазы -alnagal, и способ ее получения -  патент 2525682 (20.08.2014)
антитело к epha2 -  патент 2525133 (10.08.2014)
штамм бактерий escherichia coli - продуцент рекомбинантного флагеллина -  патент 2524133 (27.07.2014)

Класс C12Q1/68 использующие нуклеиновые кислоты

способ идентификации вызывающих муковисцидоз мутаций в гене cftr человека, набор праймеров, биочип, набор мишеней и тест-система, используемые в способе -  патент 2529717 (27.09.2014)
аптамер, специфичный к опухолевым тканям легкого человека -  патент 2528870 (20.09.2014)
способ выявления микобактерий туберкулеза генотипа веijing в режиме реального времени -  патент 2528866 (20.09.2014)
способ проведения пцр и пцр-пдрф для идентификации аллельных вариантов waxy-генов пшеницы -  патент 2528748 (20.09.2014)
синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации вируса блютанга нуклеотипа в (3, 13 и 16 серотипы) методом от-пцр -  патент 2528745 (20.09.2014)
способ проведения пцр-пдрф для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям а и к гена dgat1 -  патент 2528743 (20.09.2014)
синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ выявления генотипов для идентификации личности с помощью системы микросателлитных днк-маркеров y-хромосомы -  патент 2528742 (20.09.2014)
способ оценки чувствительности клеток рака легкого к доксорубицину на основании уровней экспрессии маркерных генов и набор для его осуществления -  патент 2528247 (10.09.2014)
биологический микрочип для выявления и многопараметрического анализа противохолерных антител -  патент 2528099 (10.09.2014)
набор синтетических олигонуклеотидов для амплификации и секвенирования its1-5.8s-its2 сосудистых растений -  патент 2528063 (10.09.2014)
Наверх