способ лечения и профилактики мастита и повышения молокоотдачи у коров, овец или коз

Формула изобретения

1. Способ лечения и профилактики мастита и повышения молокоотдачи у коров, овец или коз, включающий введение в их организм лекарственных средств, отличающийся тем, что в качестве лекарственных средств используют цитокин, активизирующий функцию фагоцитарных клеток или иммунную систему, и антибиотик, а введение осуществляют в период ранней лактации им в период инволюций молочной железы.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве цитокина используют интерлейкин-1-12, интерферон, или фактор некроза опухолей, или фактор стимуляции колоний, или фактор роста фибробластов, или фактор стимуляции гранулоцитных макрофагов, или фактор трансформации роста, или фактор активации тромбоцитов, или мутеин, или пептидный эквивалент, или его индуктор, или их комбинацию.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что интерлейкин-2 используют в количестве 0,01 40 мг на обрабатываемую четверть молочной железы, а фактор стимуляции гранулоцитных макрофагов в количестве 0,5 55 мг на обрабатываемую четверть молочной железы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к лечению или профилактике мастита у теплокровных животных на ранней стадии лактации и/или связанного с инволюцией молочных желез. Известно использование лекарственных средств, вызывающих иммунизацию организма или подавление развития патогенных микроорганизмов.

Цитокины обеспечивают полезную терапию, которая в значительной степени защищает и лечит молочную железу от новых или существующих инфекций на ранних стадиях инволюции молочной железы или при начале лактации. Такой терапевтический прием также увеличивает продуцирование молока в последующих циклах лактации. В отличие от подходов, связанных с иммунизацией и применением вакцин, в изобретении оптимизируются специфические и неспецифические защитные механизмы хозяина с целью предотвращения возникновения любых новых инфекций, а также ускорения нормального физиологического процесса инволюции молочной железы. Изобретение является эффективным приемом профилактики и лечения патологических инфекций у всех млекопитающих, но особенно у молокопродуцирующих теплокровных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, козы или буйволы. Кроме этого, применение цитокина в качестве дополнительного терапевтического средства в комбинации с традиционным антибистическим лечением заболеваний оказывается полезным для уменьшения вероятности новых инфекций, улучшения эффективности действия, и/или уменьшения количества антибиотика, требуемого для терапевтического лечения, в результате чего уменьшается расход лекарства.

Одним из заболеваний, имеющих важное коммерческое значение является мастит, воспаление молочной железы. Это заболевание имеет множество бактериальных этиологий и ежегодно вызывает большие потери в производстве молока. Инфекции молочных желез представляют собой полезную модель для изучения большого числа инфекционных заболеваний органов теплокровных животных, одним из которых является мастит. Хотя внутригрудная антибиотическая терапия применяется на лактирующей железе, одним из наиболее эффективных терапевтических приемов лечения мастита является внутригрудное вливание антибиотиков в конце лактации (истощение). Такая терапия может быть достаточно эффективной при лечении инфекционных состояний во время истощения лактации.

Цитокины обладают положительным иммуномодуляторным эффектом на иммунную систему хозяина, а также оказывают влияние на нормальное биологические процессы инволюционирующей железы. Изобретение в значительной мере предотвращает возникновение и частоту новых бактериальных инфицирований деградирующих молочных желез млекопитающих. Кроме этого, в качестве дополнительного метода к современной антимикробиальной терапии коров способ изобретения обеспечивает улучшенную эффективность действия, понижение дозировки при лечении и минимизацию расхода лекарства. Кроме этого, способ изобретения является эффективным методом в отношении инфекций, обладающих развитой сопротивляемостью к классической антимикробиальной терапии.

На фиг. 1 показана реакция молочной железы коров на дозу внутригрудинно вливаемого рекомбинантного цитокина

Пять серийных разбавлений r-BoIL-1 (рекомбинантный коровий интерлейкин-1) в количестве от 312,5 мкг до 0,5 мг (0-0), r-BoIL-1(рекомбинантный коровий интерлейкин-2) в количестве от 40 мг до 0,1 и r-BoGM-CSF (фактор стимуляции рекомбинантной коровьей гранулоцитной макрофаговой колонии) в количестве от 0,2 до 5,0 мг применяли в момент времени "0" на 3-4 молочных железах нормальных лактирующих молочных Гольштейнских коров. В 54 четвертинки молочных желез, по 3-4 в группе, вливали после утренней дойки через сосковый канал различные концентрации рекомбинантных коровьих цитокинов. Отбирали образцы молока и подсчитывали на приборе CoulterLM, снабженным канальным анализатором C256, число жизнеспособных соматических клеток. Полученные данные выражены числом соматических клеток на 1 мл молока.

На Фиг. 2 4 показано количество и качество молочных PMN, полученного из молочных желез, в которые было произведено вливание r-BoIL-1 или r-BoIL-2.

В 12-ти молочных железах нормально лактирующих молочных коров разновидности Гольштейн, через сосковый канал вливали 200 мкг r-BoIL-1, 2 мг r-BoIL-2 или 1 мг r-BoGM-CSF. Отбирали образцы молока и на приборе CoulterLM с канальным анализатором C256 подсчитывали число жизнеспособных соматических клеток. Полученные данные выражали как число соматических клеток на 1 мл образцов молока, отобранных через 16, 40, 64 и 88 ч после вливания r-BoIL-1 (А), r-BoIL-2 (D) или r-BoGM-CSF (C). Общий процент фагоцитоза молочных PMN (полиморфонуклеарные клетки) количественно измеряли методом цитометрии в потоке, в результате определения процентного количества проглатывающих 2 мкм флуоресцентные шарики для r-BoIL (B), r-BoIL-2 (E) или R-BoGM-CSF (H). Всю популяцию вначале обрабатывали импульсами рассеянного света под передним углом, FALS и рассеянным светом под углом 90^o с целью учета числа жизнеспособных полиморфонуклеарных клеток. За индукцией супероксида после PMA (520 г ) стимуляции также следили с использованием цитохром-c восстановительного анализа на целые клетки в случае r-BoIL-1(C) r-BoIL-2(Г) или r-BoGM-CSF (I). PMN из необработанного молока не могут индуцироваться с получением супероксида, тогда как периферические кровяные PМN способны индуцироваться в интервале 5-15 MO₂ /мин/ 10⁷PMN.

На Фиг. 5 и 6 показано вырабатывание молока после внутригрудинного вливания или внутри мышечной инъекции r-BoIL-2 лактирующим молочным коровам.

Среднюю выработку молока в килограммах, стандартная ошибка, записывали для 8 лактирующих молочных коров, после внутригрудинного вливания r-BoIL-2 или при отсутствии обработки. Полученные данные представляли в виде процента среднего значения выработки молока (стандартное отклонение) в сравнении с первыми пятью днями до обработки (среднее значение для 100% уровня продуцирования).

Продуцирование после внутригрудинного вливания r-BoIL-2 при общем уровне дозировок 4,5 мг или 13,5 мг в четвертях инфицированных St aureus сравнивали с соответствующими значениями для инфицированных, необработанных коров (-) в течение 6-дневного периода. Аналогичным образом регистрировали выработку молока у 7 лактирующих коров при инъекциях r-BoIL-2 в количестве 2,5 мкг /кг/ день в течение 5 дней (о-о) и сравнивали полученные значения с 3 обычными контрольными объектами, которым инъектировали PB (-), часть B. Все коровы во время терапии с помощью r-BoIL-2 находились в диапазоне от средней до поздней стадий их второй или третьей лактации. Все влияния на выработку молока имели обратимый характер и через 96 ч после прекращения обработки наблюдаемые значения возвращались на уровень, соответствующий значениям до обработки.

На Фиг. 7 показано измерение остаточной r-BoIL-2 биоактивности в секрециях молочных желез коров, в которые было произведено вливание r-BoIL-2.

В секреции от 4-х четвертей (4 различных коровы) вливали по 1 мг r-BoIL-2 на стадии истощения (2 четверти) или без обработки R-BoIL-2 (2 четверти). Сухие секреции желез собирали через 0,72, 144 и 240 ч после вливания. Все показанные образцы отсчитывались от временной точки 72 ч и их разбавляли в соотношении 1:50 и 1:200,после чего проводили анализ на количество биологически активного r-BoIL-2 с использованием IL-2 зависимой ВТ-2 Т-клеточной линии. ВТ-2 клеточная линия представляет собой коровью Т клеточную линию,для роста которой требуется IL-2. В результате измерения степени пролиферации такой клеточной линии можно непосредственно измерить количество биологически активного IL-2 в испытуемой среде. Полученные данные выражали, как среднее значение внедрения 3Н-тимидина стандартное отклонение при трехкратном дублировании опытов с использованием клеток ВТ-2 для каждого из индивидуально пронумерованных животных. Ни в один из временных периодов не было зафиксировано r-BoIL-2 активности в четвертях контрольных животных (коровы556 и802) и в четвертях животных обработанных r-BoIL-2 (коровы805 и809). Стандартный анализ различных концентраций r-BoIL-2 в 2% сухих секрециях также представлен в части А, как положительное контрольное значение.

На Фиг. 8 показана фагоицитная способность PMN после применения цитокина при использовании молочных желез ранней стадии инволюции. Использовали 4 молочных железы от двух молочных коров разновидности Гольштейн, которые недавно вступили в сухой период. Все четверти (quarters) инфицировали S.aureaus в течение 4-6 недель перед обработкой. Две четверти обрабатывали Cefa-Dri а две четверти обрабатывали Cefa-Dri+1 мг коровьего II-2 путем внутригрудинного вливания сразу после последней дойки до истощения. Сухие коровьи секреции собирали на 3- и 6-й день периода истощения лактации и число жизнеспособных соматических клеток подсчитывали на Coulter снабженным канальным анализатором C256. Общий процент фагоцитоза под действием РМN количественно измеряли методом цитометрии в потоке путем измерения процента клеток,потребляющих флуоресцентные клетки размером 2 мкм.

На Фиг. 9 показана ранняя выработка молока при лактации до и после внутригрудинного вливания r-BoIL-2, как терапия коров в период истощения.

Среднее значение выработки молока в кг (стандартное отклонение) показано для 4-х коров в первые шесть дней после начала лактации сразу до обработки и сразу после обработки. Следили за продуцированием после r-BoIL-2 обработки (O-O) или в течение того же времени, за лактацией до обработки (O-O). Средняя доза r-BoIL-2, полученная каждой из коров,составляла 2 мг. Три коровы завершили вторую лактацию и одна завершила свою третью лактацию ко времени применения r-BoIL-2 терапии. На одних и тех же животных сравнивали продуцирование молока после обработки, начиная с третьей или четвертой стадии лактации с соответствующими значениями продуцирования в течение первых 6 дней после инициирования второй или третьей лактации (предварительная обработка).

Изобретение относится к профилактике или лечению мастита у животных при ранней стадии лактации или при наличии инволюции молочных желез (терапия истощенных коров) в результате применения цитокинов на животном в течение указанного периода,известного так же, как период истощения лактации коров. Все животные, инфицированные маститом, который является следствием таких инфицирующих агентов, как S.aureaus, могут эффективно лечиться с помощью способа изобретения, однако, как известно, наиболее молокопроизводящими животными являются коровы, овцы и козы и в этой связи такая терапия особенно выгодна для них.

Предпочтительный способ изобретения заключается в том, что применяют фармацевтически применимый носитель в комбинации с различными циктосинами или индукторами цитокинов, причем применяемое количество достаточно для реализации биологического отклика такого животного, как теплокровные животные, при прямом введении в целевую ткань (внутригрудинно) или парентерально (внутримышечно или подкожно). Кроме того, примерами цитокипов,используемых в изобретении, могут служить интерлейкины (интерлейкины 1-12), интерферон, такие факторы, стимулирующие колонии, как фактор стимуляции гранулицитной колонии, фактор стимуляции макрофаговой колонии или фактор стимуляции гранулоцитной макрофаговой колонии, фактор роста фибробластов, фактор трансформации роста, фактор активации лейкоцитов, факторы роста, полученные из эритроцитов, или факторы некроза опухолей. Предполагается также, что мутеины таких соединений, их пептидные эквиваленты, а также индукторы таких соединений входят в сферу изобретения. Было установлено, что комбинации таких соединений являются эффективными агентами в терапии инфекций известных в настоящее время. Следует отметить, что в случае заболевания коров, коз и овец соединения изобретения могут быть непосредственно применимы через сосковый канал на молочной железе. Такую обработку можно повторять, особенно в период до инициирования лактации.

В связи с этим целью изобретения является разработка способа лечения или профилактики маститных инфекций у теплокровных животных в периоде истощения лактации (dry-cow period) на ранних стадиях лактации и/или при инволюции молочных желез. Другой целью изобретения является композиция, предназначенная для такого лечения или профилактики. В композициях,содержащих такие цитокины изобретения, могут содержаться колонии интерлейкина-2 и/или гранулоцитных маргофагов.

Эти и другие цели изобретения раскрыты в следующих примерах, в описании изобретения, причем примеры носят иллюстративный характер и не ограничивают сферу изобретения.

Пример 1. Зависимость дозировки и биологических характеристик вливаемого цитоксина Как r-BoIL-1,так и r-BoIL-2 индуцируют инфильтрацию соматических клеток в молоко при относительных дозировках, указанных выше, тогда как r-BoCM-GSF не демонстрирует существенно хемоатрактантной активности (фиг.1). Важно отметить, что минимальная эффективная доза и максимальная толерантная дозировка для r-BoIL-1 и BoIL-2 составляет 0,5-1000 и 0,5-300 мг соответственно, причем следует отметить, что при внутригрудинном вливании до 5 мг r-BoCM-GSF не удается достичь существенного притока клеток в молочные железы. Такие дозировки являются важной основой для оценки количественной индукции соматических клеток, однако следует иметь в виду, что в области пониженных дозировок могут регистрироваться существенные положительные количественные изменения. Удельная биологическая активность r-BoIL-1 в качестве хемоаттрактанта примерно в 10000 раз выше, чем у BoIL-2 хотя в испытаниях in vitro удельные биоактивности эквиваленты. Такое несоответствие может объясняться активным ингибированием II-2 или пониженной биостабильностью в молоке. Максимальное число клеток после вливания r-BoIL-1 при максимальной переносимой дозировке в 4-5 раз выше, чем для r-BoIL-2.Кинетика РМN миграции в молочную железу такова, что миграция происходит на 8-24 ч быстрее в случае вливания r-BoIL-1 или вливания r-BoIL-2 в зависимости от дозировки. После вливания r-BoIL-1 или R-BoIL-2 доминантным клеточным типом является PMN.

Помимо количественных изменений молочных PMN после вливания цитокина наблюдаются также и качественные изменения (активации). r-BoIL-1 индуцирует начальное 150-кратное повышение числа PMN по сравнению с уровнем до обработки через 16ч, понижение в 20 раз через 40 ч и восстановление этого числа на нормальном уровне через 112 ч (фиг.2, A). Количество индуцирующего супероксида в ходе стимуляции форболовым эфиром значительно увеличено по сравнению с числом резидентных PMN (фиг.2,C). Способный к индукции супероксида из резидентных молочных PMN в значительной степени заинтригован и составляет лишь 5% от его количества в периферических кровяных PMN того же животного. фагоцитоз не подвергается влиянию при внутригрудинном применении r-BoIL-1 (фиг. 2, B), на основании чего можно предположить, что восстановление PMN активируются или подвергаются первичному воздействию антигена лишь частично.

Применение r-BoIL-2 вызывает также количественное повышение молочных PMN (фиг. 2,D), число которых уменьшается через 72 ч до контрольных значений при дозировке 2 мг. Как и в случае применения R-BoIL-1, способный к индукции супероксид значительно увеличивается в количестве по сравнению с числом резидентных PMN (фиг.2,Г), и это количество остается постоянным в течение 96 ч отбора образцов. Степень фагоцитоза увеличивается в 2-3 раза по сравнению с резидентными PMN за 40-64 ч после начальной отметки времени и хотя процент фагоцитоза понижается к 112 ч, это количество все еще выше уровня до обработки (фиг.3,Е). В ходе активации повышается также среднее количество перевариваемых шариков в расчете на фагоцитную клетку. Замедление пиковой фагоцитной активности по сравнению с подсчетами соматических клеток позволяет предположить, что существует очевидная возможность регулирования активации и хеоматтрактации.

Применение r-BoGM-CSF не позволяет сделать вывод о том, что имеет какое-либо значительное количественное увеличение числа молочных PMN (фиг.2, C), даже при применение дозировок внутригрудинного применения 5 мг. Однако биологическая активность,измеренная по продуцированию способного к индукции супероксида, повышается по сравнению с резидентными PMN (фиг.4,Г). Кроме того, как следует из данных фиг.2Н, повышается процентное содержание клеток определяемых, как фагоцитные. Увеличение степени фагоцитоза сохраняется на уровне выше значений до вливания в течение, вплоть до 112 ч.

Пример 2. Выработка молока лактирующими железами после внутригрудинного вливания. Проводили in vitro измерений ежедневной выработки молока как после внутригрудинных вливаний, так и после внутримышечного вливания. Проводили дойку коров вечером и утром и количество полученного молока взвешивали и регистрировали в виде числа кг/день. Общая дозировка IL-2, применяемого в расчете на корову, составляло 2-96 мг. Единичное или многократное применение IL-2 путем внутригрудинного вливания оказывало различное действие на продуцирование молока индивидуальными животными в расчете на общую дозировку r-BoIL-2, которую применяли в течение дня(Фиг.5)внутригрудинно. Выработка молока уменьшалась на 30-40% к третьему вливанию при высших дозировках (13,5 мг), тогда как наблюдалось лишь 12%-ное уменьшение при дозировке (4,5 мг), что статистически не отличается от продуцирования молока в момент времени "с" или от значений у контрольных животных. Статистически значимого эффекта на выработку молока не наблюдалось при значениях дозировок менее 4,5 мг. Этот факт позволяет предположить, что секреторный эпителий молочной железы может индуцироваться до физиологического состояния, соответствующего отсутствию секреции под действием цитокина. Такая индукция имеет важное значение в отношении морфологических изменений, которые необходимы на ранних стадиях лактации и которые служат средством ускорения работы защитных механизмов. Аналогичные эффекты на выработку молока наблюдались при внутримышечном вливании r-BoIL-2 при дозировке 2,5 мкг/кг веса тела/день в течение 5 дней (внутримышечно).

Пример 3. Фармакокинетика применения цитокина на истощенных коровах. С целью специального исследования наличия цитокинов после однократного внутригрудинного вливания в истощенных коров, 5-ть четвертей от четырех различных коров подвергали вливанию 1 мг r-BoIL-2. Поскольку истощенная железа не воспроизводит молокообразования каждые 12 ч, исследовали сохранение биологической активности r-BoIL-2, влитого в истощенную железу через 72 ч или более. Секреции четвертей истощенных коров,обработанных 1 мг r-BoIL-2, собирали через 72, 144 и 240 ч после обработки коров. Как и в случае молока производили разбавление сухих секреционных образцов в соотношении 1:50 и такие растворы анализировали методом биоанализа с применением ВТ-2 и сравнивали с аналогичными значениями, полученными в присутствии r-BoIL-2, разбавленного средой. Как показано на фиг. 7, в обработанных железах не детектировалось r-BoIl-2 биоактивности (менее 0,024 кг/мл) через 72 ч после вливания. В связи с этим можно сделать вывод о том, что цитокины вызывают положительное длительное изменение в защитных механизмах железы и при этом значительно превышаются временные пределы детекции биологической активности железы.

Пример 4. Профилактика мастита у лактирующих животных Потенциальные преимущества применения экзогенного цитокина на организме хозяина, в том что касается различной индукции количественных и качественных изменений молочных PMN, дополнительно исследовались в профилактических и терапевтических экспериментах. R-BoIL-1, r-BoIL-2 и r-BoGM-CSF способны защищать организм хозяина от последующего заражения штаммом S.aureus (табл. 1). Защитный эффект r-BoIL-1 особенно эффективен при его применении за 24 ч до заражения S.aureus. Такая максимальная защита коррелирует с пиковым количественным биологическим откликом на действие цитокина. Защитный эффект r-BoIL-2 наиболее эффективен при применении за 48 ч до заражения S. aureus. Эта также коррелирует с пиковой биологической реакцией на действие такого цитокина и также подтверждает качественное увеличение степени фагоцитоза и способного к индукции супероксида (фиг. 3,Д,Е). В отличие от r-BoIL-1 и r-BoIL-2,r-BoCM CSF вызывает лишь незначительные количественные изменения в отношении молочных РМN. Однако, хорошая защита от S.aureus наблюдается при применении r-BoCM- CSF как за 24, так и за 48 ч до заражения. Показано, что оба этих временных периода повышают фагоцитную способность клеток в молоке обработанных желез фиг. 4.

Примечание к табл.1.

1. Однократное внутригрудинное вливание применялось после РМ дойки. Обрабатывали 100 молочных желез от 22 различных лактирующих коров разновидности Гольштейн.

2. Все железы были бактиологически чистыми на 5-ти последовательных образцах после АМ дойки до начального вливания.

3. Указана общая дозировка в массе протеина. Биологическая активность r-BoIL-1,r-BoIl-2 и r-BoGM-CSF составляет 32000, 22000 и 38000 ед/мкг соответственно.

4. Вливание цитокинов проводили одновременно с S.aureus через 0,24 и 48 ч до заражения 30 200 CFY S.aureus.

5. Индивидуальные железы считались вылеченными, сли образцы молока не содержали S.aureus

6. Контроля /1- /% инфицированных после терапии деленный на количество инфицированных в контрольных четвертях // х 100. * Четверти в контроле 1 заражали 250 CFY S.aureus Четверти в контроле 2 заражали 30 CFY S. aureus

Пример 5. Терапия адаптированных инфекций с помощью цитокинов

Как показано в табл. 2, инфицированные железы также эффективно обрабатывали путем внутригрудинного влавания r-BoIL-1 и r-BoIL-2. Оба цитокина проявляли зависимость типа доза -терапевтическая активность. Наибольшая эффективность r-BoIL-1 и r-BoIL-2 проявляется в случае применения дозировок в ходе 3-х последовательных доек, а не единым приемом. Процентное количество четвертей, у которых инфицирование исчезает за период более одной дойки (РЕАКЦИЯ), в сравнении с процентным количеством четвертей, у которых полностью отсутствует инфицирование (ЛЕЧЕНИЕ),является мерой неспособности клеток хозяина уничтожать бактерии. Скорость рецидива максимальна для r-BoIL-2 (общая скорость рецидива порядка 40% для 3-кратной дозировки в 10 мг). Высокая скорость рецидива для r-BoIL-1 позволяет предположить, что хотя имеет место переваривание большинством клеток S.acreus, также клетки неспособны уничтожать бактерии. Скорости рецидива для r-BoIL-1 (54%) сравнимы с действием цефарина натрия (57% ), хотя скорости рецидива для r-BoIL-1 (54%) лучше всего аппроксимируются с действием Cefa-Lac (16%), причем общие скорости излечения не столь эффективны, как при применении Cefa Lac Этот факт позволяет предположить, что активация фагоцитных клеток в молоке является существенным компонентом эффективной терапии в отношении действия инфекционных агентов. Кроме того, следует отметить, что если активация клеток хозяина эффективна, на что указывает действие к-BoIL-2 и r-BoGM -CSF, то полезной может оказаться комбинационная терапия с использованием r-BoIL-1 или антибиотиков.

Биологическая активность PMN, а также число PMN в ходе инфицирования маститом подвержены изменениям в зависимости от природы животного и индивидуальных особенностей инфицированной железы. Совершенно очевидно, что активация фагоцитоза необходима для эффективного устранения бактерий, но недостаточна без надлежащей активации бактерицидных компонентов фагоцитной клетки. Такая диссоциация активации фагоцитоза без активации бактерицидной активности фактически способствует возникновению источника реинфицирования, как отмечалось выше. Такая биологическая активность может быть точно модулирована путем локального in vivo применения рекомбинантных гомологических цитокинов на целевом органе.

Примечание к табл.2.

1. Инфицирование S.aures проводили за 2-3 недели до обработки. Обработку проводили после АМ или РМ дойки путем 1 -3 последовательных внутригрудинных вливаний. Использовали 120-ть молочных желез от 28-ми различных лактирующих молочных коров, разновидность Гольштейн. Рекомбинантный коровий интерлейкин-1 /П-1/ и интерлейкин-2 /П-2/ получали от ИММУНЕКС Корп. Сиэтл, W.A. Цефапирин натрия готовили в РВ, а Cefa-Lak (Бристоль-Мейерс) использовали в соответствии с прилагаемой инструкцией.

2. Цитокины вводили внутригрудинно через сосковый канал после РМ дойки через указанные интервалы. Дозировку распределяли в общем объеме 10 мл стерильной PBS. Биологическая активность r-BoIL-1 и r-BoIl-2 составляла 32000 г и 22000 ед/мкг соответственно. Дозировку вливания 200 мг цефапирина натрия и Cefa-Lak применяли после РМ и АМ доек в соответствии с описанными методиками.

3. отклика число четвертей случайно />одной дойки/ не содержащих S. aureus, деленный на общее число обработанных четвертей.

4. извлеченных четвертей четвертей без инфицирования и не содержащих S. aureus, деленный на общее число обработанных четвертей. Инфицирования считались рецидивными, если в трех последовательных дойках AM имели > 1 CFY или при двух последовательных терапиях в любое время в течение 14-дневного периода имели > 20 CFY.

5. рецидива /1-/ отклика, деленный на извлечения // x 100.

Пример 6. Фагоцитная активность клеток из секреций истощенных коров после применения цитокинов. Соматические клетки выделяли из молочных желез на 3- и 6-й день после обработки Cefa-Dri плюс П-2 или только Cefa-Dri Клетки инкубировали в присутствии флуоресцентных латексных микросфер и анализировали на поточном цитометре на их способность фагоцитировать шарики. Как показано на фиг.8, фагоцитная активность увеличивается к 6-му дню по сравнению с 3-им днем в инфицированных четвертях для обеих обработанных групп и еще биологически не активный П-2 детектируется через 3 дня(фиг.7). В отличие от этого фагоцитная активность понижается в инфицированных четвертях к 6-му дню по сравнению с 3-им днем для обеих обработанных групп. Эти данные подтверждают тот факт, что клетки желез с установленной инфекцией во время истощения сохраняют более высокий уровень фагоцитной активности, чем клетки желез, уничтоживших инфицирование ко времени истощения. Кроме этого, видно, что обработка П-2 повышает фагоцитную активность клеток истощенных желез.

Пример 7. Профилактика инфицирования Nocardia в результате обработки цитокинами. Две группы из 17-ти четвертей молочных желез от 10-ти различных коров разновидности Гольштейн использовали для исследования традиционной терапии истощенных коров с применением Cefa-Dri или их терапии с применением этого же агента плюс 1 мг рекомбинантного коровьего интерлейкина-2 /П-2/. Было установлено, что антибиотическая обработка инфекций типа Nocardia оказалась неэффективной. Как следует из данных табл.3, обработка Cefa-Dri приводила к 72%-ному инфицированию желез после их заражения погружением в бульон с Nocardia. Однако, лишь 53% желез инфицируются, если терапия включает использование рекомбинантного П-2.

Примечание к табл.3.

1. Индивидуальные четверти погружали в бульон с 10⁸cfu /мл Nocardia в стадии истощения. Затем все соски погружали в водный раствор и обрабатывали соответствующим методом, применимым к истощенным коровам.

2. После последней дойки PM производили однократное внутригрудинное вливание. Обработке подвергали 34 молочных железы от 10-ти различных коров разновидностей Гольштейн, входящих в период истощения.

3. Указана общая дозировка по массе протеина. Биологическая активность r-BoIL-2 составляет 22000 ед/мкг. Вливание r-BoIL-2 осуществляли совместно с применением Cefa-Dri

4. Все четверти обнажали через указанные интервалы времени и их сухие секреции исследовали на наличие Nocardia

Пример 8. Профилактика раннего инфицирования Staphylococcus aureus при инволюции молочной железы. Использовали две группы из 12-ти четвертей инфицированных S. aureus молочных желез от 6-ти различных молочных коров разновидности Гольштейн с целью исследования на них традиционной терапии истощенных коров Cefa-Dri или терапии для истощенных коров плюс 1 мг рекомбинантного коровьего интерлейкина -2/IL-2/. Через 8-10-ть дней после обработки в стадии истощения отбирали образцы секреции и их испытывали на наличие остаточных антибиотиков или бактерий. Затем все четверти повторно заражали 50 250 CFV S. aureus и животным давали возможность кормить детенышей. В ходе инициирования лактации образцы отбирали в ходе трех последовательных доек и их испытывали на наличие S.aureus. Было установлено, что все четверти обработанные только Cefa-Dri оказались инфицированными. Однако, как следует из данных,представленных в табл.4, четверти,обработанные 40% Cefa-Dri плюс IL-2, не были инфицированными на стадии инициирования лактации.

Примечание к табл.4.

1. Все четверти инфицировали Staphylococcus aureus (новый штамм 305) как минимум за 2 недели до истощения.

2. Использовали однократное внутригрудинное вливание после последней PM дойки в случае применения Cefa-Dri Животным,обработанным r-BoIL-2,вливали r-BoIL-2 и затем Cefa-Dri. Обработке подвергали 20-ть молочных желез от 7 различных молочных коров разновидности Гольштейн в начальной стадии истощения.

3. Указана общая дозировка по массе протеина. Биологическая активность r-BoIL-2 составляет 22000 ед/мкг.

4. Четверти выдавливания на 10-й день и их сухие секреции исследовали на наличие S.aureus.

5. Из всех четвертей дважды отбирали образцы в течение 405 дней после отела и молоко детектировали на наличие S.aureus

Пример 9. Увеличение выработки молока при лактации сразу после терапии истощенных коров с помощью цитокинов. Оценивали влияние r-BoIL-2 на возможную выработку молока после терапии истощенных коров. Выработку молока тремя молочными коровами в течение первых пяти дней лактационного цикла (вторая или третья лактации) до обработки r-BoIL-2 сравнивали с выработкой молока в течение первых пяти дней лактационного цикла /третья или четвертая лактация/ непосредственно после обработки r-BoIL-2 (фиг.6). Не наблюдалось ингибирования выработки молока и было отмечено 80% увеличения выработки молока в ходе последующей лактации после обработки r-BoIL-2.