способ получения противостолбнячного иммуноглобулина

Формула изобретения

Способ получения противостолбнячного иммуноглобулина путем последовательной сорбции иммуноглобулинового препарата и элюции его на иммуносорбенте, содержащем в качестве антигена анатоксин столбняка, отличающийся тем, что в качестве исходного сырья используют комплексный иммуноглобулиновый препарат, а элюцию антител проводят 3 MgCl₂6H₂O, 0,075 M Hepes /NaOH pH 7,2.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунологии, и может быть использовано для иммунопрофилактики и иммунотерапии столбняка.

Выпуск антистолбнячного гомологичного ИГ в нашей стране ограничен и не удовлетворяет запросы практического здравоохранения. Это связано с недостаточностью сырьевой базы, обусловленной в свою очередь ограниченностью донорского контингента и несовершенством схем иммунизации. В результате огромное количество людей получает гетерологический (лошадиный) противостолбнячный иммуноглобулин с профилактической целью и вследствие этого аллергизируется чужеродным белком. За рубежом гомологичный препарат практически полностью вытеснил применение гетерологичной лошадиной противостолбнячной сыворотки.

Понятно в этой связи, какое огромное значение имеет разработка в нашей стране гомологичного противостолбнячного ИГ.

Известен способ получения специфического противостолбнячного ИГ из иммунной донорской плазмы с использованием метода спиртового фракционирования на холоду по Cohw.Метод используют при содержании противостолбнячных антител от 10 и более ME/мл (ME международная единица) в исходной плазме. Недостатком способа является необходимость использования гипериммунизации добровольцев из-за низкого содержания противостолбнячных антител в обычной донорской плазме. Повторные иммунизации нежелательны, так как вызывают ряд иммунологических расстройств. Кроме того, степень очистки по этому методу не превышает 10, а выход антител по активности составляет всего лишь 22%

Более перспективным представляется способ выделения антител из сырья с невысоким титром с помощью аффинной хроматографии.

Известен способ получения специфического противостолбнячного ИГ методом выделения АТ из коммерческого гаммаглобулина с помощью аффинной хроматографии.

Способ позволяет получить специфический противостолбнячный иммуноглобулин с высокой степенью очистки ( 1000) и значительном выходом по активности (90% ). Однако показателя удельной активности от серии к серии значительно отличаются друг от друга.

Недостатками способа являются нестабильность показателей удельной активности и недостаточная для эффективного лечения аффинность противостолбнячных антител к токсину столбняка.

Целью изобретения является стабилизация и увеличение показателей удельной активности препарата.

Цель достигается тем, что вместо коммерческого иммуноглобулина в качестве сырья используют комплексный иммуноглобулиновый препарат (КИП), а элюцию антител с сорбента осуществляют буфером 3,0M MgCl₂ 2H₂O, 0,075 M Hepes /NaOH, pH 7,20.

КИП содержит иммуноглобулины 3-х классов: G, M и A (соответственно 50 - 70% и по 15-25%). JgG в КИП частично относится к подклассу JgG₂ (30%), который содержит антитела к столбнячному токсину и обуславливает высокую аффинность JgG именно к токсину столбняка.

В прототипе для извлечения из коммерческого гаммаглобулина противостолбнячных антител используется столбнячный анатоксин. Во время элюции с сорбента, на который нанесен анатоксин, снимаются антитела, относящиеся к JgG₁ п/кл, т. е. антитела к анатоксину (в коммерческом препарате антитела JgG₁ п/кл составляют 70%). В КИП антитела JgG1 п/кл практически отсутствуют ( 3-5% ), поэтому при нанесении на колонку с сорбированным анатоксином компл. иммун. преп. с нее можно элюировать в основном АТ к JgG₂ п/кл, т.е. АТ к токсину столбняка и часть к JgG₄ п/кл антитела к анатоксину. Иными словами, противостолбнячные АТ, извлеченные из КИП, в отличие от АТ, извлеченных из коммерческого гаммаглобулина, обладают большей аффинностью к токсину столбняка. Такой препарат будет значительно эффективнее и предпочтительнее для лечения столбняка, т.к. реакция нейтрализации токсина пойдет легче и быстрее при наличии АТ с более высокой аффинностью.

В качестве съемного буфера для элюции сорбированных АТ с колонки предлагается вместо 0,2 M уксусной кислоты pH 3,5-буфер 3,0 M MgCl₂ 6 H₂O; 0,075 M Hepes /NaOH, pH 7,20.

Введение этого буфера позволяет устранить денатурирующее воздействие кислоты на белковый раствор. Одновременно устраняется и стадия нейтрализации до pH 6,8. Масштабирование процесса с применением стадии немедленной нейтрализации неизбежно привело бы к значительной потере как самого препарата, так и его удельной активности.

Пример 1. Очистка столбнячного анатоксина. Анатоксин очищают на анионообменнике (DEAE-декстран МПК 2000), используя отрицательный заряд молекулы при pH 6,8-7,2 (p13,5). Анионообменная колонка содержит 10 г DEAE-декстран МПК конъюгата, приготовленного по методу Jayot et al. Стартовый буфер 0,01 M фосфат натрия, pH 6,8 с 0,154 M NaCl. Проба содержит 100 мл столбнячного анатоксина с удельной активностью 216 EC/мг в том же буфере. Элюцию осуществляют 0,01 M фосфатом натрия, pH 6,8 с 0,4 M NaCl. Таким образом, с 10% -ной потерей активности получают анатоксин с удельной активностью 425EC/мг25.

Пример 2. Получение иммуносорбента. 50 мл макропористого стекла с диаметром пор 200 нм обрабатывают 2%-ным раствором 3-глицидоксипропилтриметоксисилана в ацетоне и выдерживают при 100-110^oC в течение 6 ч. К 10 г глицидоксипропилстекла добавляют 500 мл лиганда (столбнячного анатоксина) с концентрацией 1,5 мг/мл в 1 M KH₂PO₄ буфере с pH 7,0. Раствор лиганда циркулирует на колонке со стеклом в течение 24 ч. Сорбент отмывают от несвязавшегося лиганда 0,5 M KH₂PO₄ pH 7,0 и блокируют эпоксигруппы 0,5 M глицин-NaOH буфером с pH 7,2 в течение 72 ч. Колонка с готовым иммуносорбентом промывается элюирующим буфером и переводится в стартовый: 0,2 M глицин-NaOH pH 7,2 с 0,2M NaCl.

По данным иммуноэлектрофореза по Лорреллу с сорбентом связалось 80% лиганда, т.е. концентрация лиганда на матрице составила 60 мг/г сорбента.

Пример 3. Получение противостолбнячных антител. На колонку с сорбентом по примеру 2, уравновешенную стартовым буфером (0,2 M глицин NaOH, pH 7,2 с 0,2 M NaCl), наносили 1000 мл 6%-ного раствора КИП в том же буфере. Элюцию осуществляли 3 M MgCl₂ 2H₂O; 0,075 M Hepes NaOH, pH 7,20.

После элюции раствора диафильтровали до 1% по белку 0,01 M фосфатным буфером, pH 6,8 с 10%-ной мальтозой. Выход по активности составил 90% фактор очистки 100. Удельная активность 70 ME/мг стабильна в 7 сериях ( см.таблицу). В прототипе показатели колебались от 49 до 79 ME/мг. По данным хроматографии, на ультрагеле A A 34 полученные антитела были представлены в основном JgG мономером 2-го п/кл. (>90%).

Предлагаемый способ имеет преимущества, т. к. не усложняя технологию производства, позволяет увеличить и стабилизировать показатели специфической активности препарата и его аффинность к столбнячному токсину.