способ получения суммы экстрактивных веществ, обладающих адаптогенной активностью

Формула изобретения

Способ получения суммы экстрактных веществ, обладающей адаптогенной активностью, путем экстрагирования растительного материала раствором эталона, отличающийся тем, что в качестве растительного сырья используют черные, перезимовавшие листья бадана, экстракцию проводят 55 65%-ным этиловым спиртом в соотношении сырье экстрагент 1 10 11 три раза при комнатной температуре в течение 72 ч, отфильтрованные спиртовые извлечения упаривают, концентрируют и высушивают в вакуум-сушильном шкафу.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к фармацее и касается способа получения биологически активных веществ из растительного сырья.

Известен способ получения средства, обладающего адаптогенной активностью, включающий экстракцию корней элеутерококка раствором этанола (ВФС 42-1281-82). Недостатком указанного способа является низкий выход экстрактивных веществ (6), ограниченность ресурсов этого сырья и высокая его стоимость.

Целью изобретения является повышение выхода действующих экстрактивных веществ и удешевление конечного продукта за счет рационального использования широко распространенного растительного сырья, имеющего надежную, обеспеченную сырьевую базу.

Указанная цель достигается посредством того, что способ включает экстракцию 55 65 раствором этанола высушенного растительного сырья - черных перезимовавших листьев бадана. Соотношение сырье экстрагент составляет 1 (10 11). Экстракцию проводят при комнатной температуре (18 - 22^oC) в течение 72 ч трехкратно. Конечный продукт получают высушиванием концентрированного экстракта в вакуум-сушильном шкафу. Предлагаемый способ получения суммы экстрактивных веществ достаточно прост, не требует трудоемких затрат, позволяет получить продукт постоянного состава.

Выявленные отличительные признаки позволяют сделать вывод о соответствии предлагаемого способа критерию "новизна".

Для доказательства существенности предложенных признаков способа, а именно концентрации экстрагента, соотношения сырье экстрагент, длительности и кратности процесса экстракции были проведены серии экспериментов, данные которых представлены ниже.

Измельченные сырья проводили согласно требованиям ГФ Х1 изд. Коэффициент поглощения экстрагента данным сырьем при степени измельчения 1 мм составляет 4,0; при степени измельчения 2 мм 3,3.

Выбор оптимальных параметров экстракции контролировали по выходу действующих веществ флавоноидов и по экстрактивным веществам.

Для подбора типа экстрагента изучены процессы экстрагирования сырья водой, этиловым спиртом различной концентрации: 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 95 Результаты анализа приведены в табл. 1. Установлено, что оптимальный экстрагент 55 65 этанол, который позволяет извлечь наибольшее количество флавоноидов основных действующих веществ в фенольном комплексе, составляющем основу полученной суммы экстрактивных веществ.

На выход экстрагируемых веществ оказывает влияние соотношение сырье экстрагент. Были проверены соотношения 1 7, 1 8, 1 9, 1 10, 1 11, 1 12, 1 13, 1 14, 1 15, 1 20, 1 25. Результаты анализа представлены в табл. 2. Как видно из табл. 2, оптимальное соотношение равно 1 (10 11), дальнейшее увеличение объема нецелесообразно, поскольку содержание действующих веществ существенно не повышается.

Продолжительность настаивания и кратность экстракции определены по следующей методике.

В круглодонную колбу вместимостью 150 мл загружали навеску сырья в количестве 5,0 г, заливали 10-кратным количеством 60 этанола, настаивали при комнатной температуре. Через определенный промежуток времени извлечение сливали, анализировали на содержание флавоноидов и экстрактивных веществ (1 контакт фаз). Частично истощенный жом заливали 60 этанолом в объеме, равном слитому, настаивали в течение того же времени, что и в первый раз. Извлечение сливали, определяли содержание флавоноидов и экстрактивных веществ (11 контакт фаз). Третье настаивание проводили так же, как и предыдущие. Сливы проводили через 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 ч. Результаты анализов представлены в табл. 3 и показывают, что равновесное состояние при I, II, III контакте фаз достигается через 72 ч (3 сут). Таким образом, трехкратная экстракция обеспечивает наиболее полный выход действующих веществ.

Изучена также зависимость выхода флавоноидов и экстрактивных веществ от степени измельчения сырья. Для проверки взяты образцы сырья, измельченные до размера частиц 0,5, 1, 2, 3, 5 мм. Данные анализа приведены в табл. 4. Измельчение сырья до размера частиц более 2 мм нежелательно, поскольку получается сырье крупного помола и резко снижается выход действующих веществ, а измельченное сырье более мелкого помола (менее 1 мм) затрудняет экстракцию сырья, фильтрацию извлечения, приводит к большему загрязнению спиртовых извлечений балластными веществами. Таким образом, оптимальные степени измельчения сырья 1 -2 мм.

В результате проведенных экспериментов установлено, что оптимальными условиями экстрагирования сырья являются: экстрагент 55 65 этиловый спирт, его соотношение к сырью 1 (10 11), время экстракции 72 ч, степень измельчения сырья 1 2 мм.

Определение выхода суммы флавоноидов и экстрактивных веществ во всех вышеуказанных экспериментах проводили по соответствующим методикам ГФ ХI изд. вып. 1,2.

Определение выхода суммы флавоноидов.

Около 1 г (точная навеска) измельченного и просеянного через сито сырья (размер частиц 1 мм), помещали в колбу на 150 мл, прибавляли 100 мл 60 этанола, экстрагировали на водяной бане при температуре 80 90^oC в течение 45 мин. После охлаждения извлечение фильтровали в мерный цилиндр через бумажный фильтр. 1 мл извлечения помещали в мерную колбу на 25 мл, прибавляли 2 мл 2 -ного алюминия хлорида в 95 этаноле и объем раствора доводили до метки 95 этанолом. Через 40 мин измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 415 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм на фоне раствора сравнения. Параллельно в тех же условиях измеряли оптическую плотность раствора ГСО рутина (ФС 42-2508-87).

Количественное содержание суммы флавоноидов (% от массы абс. сухого сырья) в пересчете на рутин-стандарт вычисляли по формуле



где D оптическая плотность испытываемого раствора;

D_o оптическая плотность раствора ГСО рутина;

М масса сырья, г;

М_o масса ГСО pутина, г;

В потеря в массе при высушивании,

Метрологическая характеристика количественного определения суммы флавоноидов в сырье представлена в табл. 5.

Относительная ошибка этого метода определения флавоноидов в 11 независимых определениях при доверительном уровне 95 не превышает 2,56

Определение содержания экстрактивных веществ в растительном сырье проводили по методике ГФ ХI изд. вып. I, с. 295.

По данным литературы, используемое сырье листья бадана содержат фенольные соединения мономерного и полимерного ряда: арбутин, гидрохинон, рододендрин, эллаговая, галловая кислоты, катехины, флавоноиды, лейкоантоцианидины, дубильные вещества гидролизуемого и конденсированного типа.

На основании качественного фитохимического анализа суммы экстрактивных веществ из черных листьев бадана установлено наличие фенольного комплекса, состоящего из флавоноидов, дубильных веществ, фенолокислот, арбутина.

Установление наличия флавоноидов в полученной сумме экстрактивных веществ.

Хроматографирование водно-спиртового извлечения на бумаге марки FN-14 в системе растворителей: 15 уксусная кислота (I) и н-бутанол-уксусная кислота-вода (4 1 2) (II), просмотр высушенных хроматограмм в УФ-свете до и после обработки 2 раствором хлорида алюминия позволило идентифицировать с аутентичными образцами флавоноиды: R_f 0,45 (I), R_f 0,4 (II), кверцетин R_f 0,05 (I), R_f 0,75 (II).

Установление наличия дубильных веществ в полученной сумме экстрактивных веществ.

При добавлении по каплям 1 раствора желатина к водно-спиртовому извлечению образуется муть, исчезающая при избытке желатина, образуется желеобразный осадок и раствор заметно осветляется.

Установление наличия фенолокислот в полученной сумме экстрактивных веществ.

Хроматографирование водно-спиртового извлечения на бумаге марки FN-214 в системе растворителей: 15 уксусная кислота (I) и н-бутанол-уксусная к-та - вода (4 1 2) (II), обработка хроматограммы в парах аммиака и просмотр в УФ-свете позволило идентифицировать с аутентичными образцами хлорогеновую кислоту R_f 0,53 (I), R_f 0,42 (II), галловую кислоту R_f 0,4 (I), R_f 0,56 (II).

Обнаружение арбутина в полученной сумме экстрактивных веществ.

Хроматографирование водно-спиртового извлечения на бумаге FN-14 в 15 уксусной кислоте, обработка раствором щелочи, затем реактивом Паули позволяет выявить присутствие в растворе арбутина, который имеет ярко-оранжевый или красный цвет и R_f 0,75.

Примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. Получение суммы экстрактивных веществ экстракцией сырья 55 этиловым спиртом (нижняя граница концентрации экстрагента). 1,00 кг сырья, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром 1 мм, загружают в экстрактор, заливают 10,0 л 55 этанола (плотность 0,9200 г/см³). Настаивают при комнатной температуре (18 22^oC) 72 ч при периодическом перемешивании и фильтруют через бумажный фильтр под вакуумом. Объем отфильтрованного слива 5,9 л (плотность 0,9242 г/см³). Шрот заливают снова 55 этанолом (плотность 0,9200 г/см³) в объеме, равном слитому (5,9 л). Проводят экстракцию аналогично первой. Второе извлечение фильтруют, объем слива 6,0 л (плотность 0,9228 г/см³) оставшийся шрот заливают снова 55 этанолом (плотность 0,9200 г/см³) в объеме, равном слитому (6,0 л). Третью экстракцию и фильтрование проводят аналогично предыдущим. Объем третьего слива 5,5 л (плотность 0,9218 г/см³). Объединенный спиртовый экстракт (17,4 л) упаривают на роторном испарителе для удаления спирта, оставшийся водный остаток сгущают на водяной бане до 1,0 л. Концентрированный экстракт высушивают в вакуум-сушильном шкафу при температуре 70 85^oC и давлении 1 атм. Получают 142,0 г сухого порошка черно-коричневого цвета, выход, соответственно, 14,2 от массы исходного сырья. Содержание флавоноидов в полученной сумме экстрактивных веществ 5,41 потеря в массе при высушивании 4,95

Фармакологические исследования полученной суммы экстрактивных веществ проводили в соответствии с общепринятыми требованиями. Об адаптогенной активности полученной суммы экстрактивных веществ судили по улучшению физической работоспособности животных (Брехман И. И. 1969). Опыты проведены на белых беспородных крысах с исходной массой 160 170 г. Сумму экстрактивных веществ вводили внутрижелудочно в экспериментально-терапевтической дозе 300 мг/кг в течение 10 дней. В качестве препарата сравнения использовали жидкий экстракт элеутерококка в дозе 5 мл/кг после предварительного удаления спирта путем выпаривания до 1/2 объема и последующего доведения объема до первоначального дистиллированной водой. Влияние суммы экстрактивных веществ на выносливость животных определяли до длительности бега в третбане до полного утомления (мин). Полученные результаты обработаны статистическим методом с использованием коэффициента Молденгауэра (Монцевичюте-Эрингене, 1964) и представлены в табл. 6.

Как видно из табл. 6, длительность бега в третбане животных после многократного введения суммы экстрактивных веществ увеличилась на 30 как и после приема экстракта элеутерококка. Таким образом, сумма экстрактивных веществ, полученная предлагаемым способом, обладает адаптогенной активностью, не уступающей экстракту элеутерококка.

Пример 2. Получение суммы экстрактивных веществ при экстракции сырья 60 этанолом.

1,00 кг сырья, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром 1 мм, загружают в экстрактор, заливают 10,0 л 60 этанола (плотность 0,909 г/см³). Настаивают при комнатной температуре 72 ч при периодическом перемешивании и фильтруют через бумажный фильтр под вакуумом. Объем отфильтрованного слива 6,0 л (плотность 0,9142 г/см³). Шрот заливают снова 60 этанолом (плотность 0,909 г/см³) в объеме, равном слитому (6,0 л). Проводят экстракцию аналогично первой. Второе извлечение фильтруют, объем слива 6,05 л (плотность 0,9156 г/см³).

Оставшийся шрот заливают снова 60 этанолом (плотность 0,909 г/см³) в объеме, равном слитому (6,05 л). Третью экстракцию и фильтрование проводят аналогично предыдущим. Объем третьего слива 5,75 л (плотность 0,914 г/см³). Объединенный спиртовый экстракт (17,8 л) упаривают на роторном испарителе для удаления спирта. Оставшийся водный остаток сгущают на водяной бане до 1,0 л. Концентрированный экстракт высушивают в вакуум-сушильном шкафу при температуре 70 85^oC под давлением 1 атм. Получают 170 г сухого порошка черно-коричневого цвета, выход, соответственно, 17 от массы исходного сырья. Содержание флавоноидов в полученной сумме экстрактивных веществ 5,21 потеря в массе при высушивании 4,01

Об адаптогенной активности полученной суммы экстрактивных веществ также судили по изменению физической выносливости животных. Опыты проводили на белых беспородных крысах с исходной массой 150 -170 г. Условия эксперимента были аналогичными предыдущим (пример 1). Полученные результаты представлены в табл. 7.

Как следует из табл. 7, длительность бега в третбане животных после многократного введения суммы экстрактивных веществ увеличивается также на 30 как в предыдущем эксперименте.

Таким образом, сумма экстрактивных веществ, полученная предлагаемым способом, также обладает адаптогенной активностью, не уступающей экстракту элеутерококка.

Наряду с этим, определена антистрессорная активность полученной суммы экстрактивных веществ, которую исследовали на модели иммобилизационно-болевого стресса у белых крыс. Стресс вызывали путем подвешивания за шейную складку в течение 22 ч животных массой 120 130 г. Устойчивость к стрессу определяли по изменению массы (в относительных единицах) надпочечников, тимуса и количеству кровоизлияний в слизистой оболочке желудка. Сумму экстрактивных веществ вводили однократно внутрижелудочно в дозе 300 мг/кг за 1 ч до иммобилизации животных. При этом было установлено, что при иммобилизационно-болевом стрессе у крыс развиваются характерные признаки в виде триады Селье: гипертрофия надпочечников, инволюция тимуса и появление кровоизлияний в слизистой оболочке желудка. Полученные результаты представлены в табл. 8.

Как видно из табл. 8, профилактическое введение животным суммы экстрактивных веществ из листьев бадана оказывает защитное действие, о чем свидетельствует уменьшение степени гипертрофии надпочечников, незначительная инволюция тимуса и уменьшение числа кровоизлияний в слизистой оболочке желудка. Таким образом, сумма экстрактивных веществ обладает выраженной антистрессорной активностью, задерживая развитие дистрофических изменений, наблюдающихся при иммобилизационно-болевом стрессе, что подтверждает данные об адаптогенной активности полученной суммы экстрактивных веществ.

Пример 3. Получение суммы экстрактивных веществ из черных листьев бадана при экстракции сырья 65 этанолом.

1,00 кг сырья, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром 2 мм, загружают в экстрактор, заливают 10,0 л 65 этанола (плотность 0,8976 г/см³). Настаивают при комнатной температуре 72 ч при периодическом перемешивании и фильтруют через бумажный фильтр под вакуумом. Объем отфильтрованного слива 6,7 л (плотность 0,904 г/см³). Шрот заливают снова 65 этиловым спиртом в объеме, равном слитому (6,7 л). Вторую экстракцию проводят аналогично первой. Второе извлечение фильтруют, объем слива 6,7 л (плотность 0,904 г/см³). Оставшийся шрот снова заливают 65 этанолом (плотность 0,8976 г/см³) в объеме, равном слитому (6,7 л). Третью экстракцию и фильтрование проводят аналогично предыдущим. Объем третьего слива 6,6 л (плотность 0,902 г/cм³). Объединенный спиртовый экстракт (20,0 л) упаривают на роторном испарителе для удаления спирта. Оставшийся водный остаток сгущают на водяной бане до 1,0 л. Концентрированный экстракт высушивают в вакуум-сушильном шкафу при температуре 70 85^oC под давлением 1 атм. Получают 149 г сухого порошка черно-коричневого цвета, выход, соответственно, 14,9 от массы исходного сырья. Содержание флавоноидов в полученной сумме экстрактивных веществ 5,10 потеря в массе при высушивания 5,91

Об адаптогенной активности полученной суммы экстрактивных веществ также судили по динамике физической работоспособности животных. Опыты проведены на белых беспородных крысах с исходной массой 160 170 г. Условия эксперимента были аналогичны предыдущим (пример 1, 2). Полученные результаты представлены в табл. 9.

Как видно из табл. 9, длительность бега животных в третбане после многократного введения суммы экстрактивных веществ увеличивается также почти на 30 как и в предыдущих опытах.

Таким образом, сумма экстрактивных веществ из черных листьев бадана, полученная предлагаемым способом, обладает адаптогенной активностью, не уступающей экстракту элеутерококка.

Кроме того, изучена острая токсичность полученной суммы экстрактивных веществ. Опыты проведены на белых беспородных мышах массой 18 20 г, которым внутрижелудочно вводили сумму экстрактивных веществ в разных дозах. Установлено, что LD₅₀ по методу Кербера при внутрижелудочном введении равно 3000 мг/кг.

Эксперименты по изучению подострой токсичности суммы экстрактивных веществ проведены на белых мышах массой 18 20 г, которым внутрижелудочно ежедневного вводили сумму экстрактивных веществ в дозах 1/15 LД₅₀ и 1/25 LД₅₀ в течение 30 сут. В течение всего срока наблюдения все животные хорошо переносили препарат, к концу срока все остались живы. Изучение основных биохимических показателей крови и макроскопическое исследование внутренних органов свидетельствовали об отсутствии отрицательного влияния на морфологический состав крови, биохимические показатели и на внутренние органы животных при введении им суммы экстрактивных веществ.

На основании полученных данных можно заключить, что предлагаемый способ позволяет получить сумму экстрактивных веществ из черных листьев бадана, не уступающую по адаптогенной активности экстракту элеутерококка.