способ получения биологически активного вещества, обладающего антиандрогенной и антиэстрогенной активностью

Формула изобретения

Способ получения биологически активного вещества, обладающего антиандрогенной и антиэстрогенной активностью, заключающийся в том, что спинной мозг животного гомогенизируют, гомогенат смешивают с 0,8 1%-ным раствором хлорида натрия при соотношении 1 10 15, экстрагируют в течение 25-30 мин при 10 18^oС, центрифугируют при 5 15^oС, надосадочную жидкость дважды насыщают сульфатом аммония, обессоливают, хроматографируют и целевой продукт лиофилизируют.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и касается способа получения биологически активных веществ из сырья животного происхождения, обладающих антиандрогенной и антиэстрогенной активностью.

Известен способ получения вещества, обладающего кардиотоническим и гипертензивным действием, включающий гомогенизацию предварительно замороженного мозга в дистиллированной воде, экстрагирование вещества хлороформом, центрифугирование, высушивание, повторную гомогенизацию с дистиллированной водой и последующим осаждением сульфатом аммония (а.с. СССР N 689015 МКИ А 61 К 35/12// C 07 C 7/00, 1979).

Недостатком данного способа является трудоемкость и сложность процесса, применение хлороформа, образующего токсичные продукты при окислении. При получении значительной партии вещества в лабораторных условиях и особенно при промышленной его добыче в окружающую среду будет поступать большой объем газообразного хлороформа, опасного для животных и человека. Кроме того, газовая смесь хлороформ воздух взрывоопасна, что может повлечь пожары и взрывы. Указанные пункты ранее предложенного способа свидетельствуют о значительных его недостатках. Кроме того, вещество, получаемое данным способом, не соответствует высокой степени чистоты, что достигается, например, при разделении веществ методом хроматографии.

Задача изобретения: упростить способ выделения биологически активного вещества, избавиться от применения экологически вредного реагента хлороформа и получить вещество высокой степени чистоты.

Достигается это путем гомогенизации спинного мозга, экстрагирования биологически активного вещества раствором хлорида натрия, центрифугирования водной взвеси мозга, осаждения вещества сульфатом аммония, растворения осадка в растворе хлорида натрия, обессоливания, хроматографирования и леофильной сушки вещества.

Способ осуществляется следующим образом: гомогенизируют спинной мозг и экстрагируют вещество при 10-18^oC в течение, например, 30 мин в 0,8-1% растворе хлорида натрия в соотношении 1:10-1:15 с добавлением ЭДТа до 0,05% центрифугируют взвесь мозга в течение 25-30 мин при 6000-9000 об./мин при 5-15^oC, дважды осаждают сульфатом аммония. При первом 9% насыщении осаждают высокомолекулярные белки, отбрасывают их и повторным насыщением экстракта сульфатом аммония до 39% осаждают биологически активное вещество, растворяют осадок в 0,85% растворе хлорида натрия, обессоливают, хроматографируют с получением чистого вещества, леофилизируют его. Выход активного вещества составляет 500 мкг на 1 кг сырья. Полученное таким способом вещество обладает выраженный антиандрогенной (табл. 1) и антиэстрогенной (табл.2) активностью. Оно имеет молекулярную массу 10 300, что подтверждено методом тонкослойной хроматографии с маркерами. Вещество разрушается протезами, инактивируется при кипячении или содержании его в термостате при 37^oC в течение 1 часа. Оно осаждается депротеинизирующими средствами: хлоридом натрия, сернокислым аммонием, тетрауксусной кислотой.

Предлагаемые в способе параметры температуры среды, концентрации экстрагента, его соотношения с гомогенатом мозга, скорость центрифугирования являются оптимально допустимыми. Так, экстрагирование ниже 10^oC ведет к возрастанию времени экстракции вещества более 1,5 часа, а выше 18^oC происходит частичная иноктивация вещества.

Концентрация раствора хлорида натрия менее 0,8% снижает степень экстракции вещества, его выход и увеличивает время этого процесса, а выше 1% способствует осаждению части вещества, снижает его выход.

Соотношение экстрагента с гомогенатом мозга менее 1:10 уменьшает степень экстракции вещества и его выход, а увеличение больше, чем 1:15 не дает положительного эффекта. Центрифугирование взвеси мозга при скорости ниже 6000 об./мин ухудшает осаждение взвешенных частиц мозга и увеличивает время этого процесса до 1 часа, а скорость более 9000 об./мин не повышает эффективность отделения взвешенных частиц мозга.

Центрифугирование при 5-15^oC необходимо для сохранения активности термолабильного вещества. Снижение температуры менее 5^oC удлиняет время осаждения взвешенных частиц до 1 часа, а выше 15^oC приводит к снижению активности вещества.

Пример 1. Берут 100 г свежего или замороженного спинного мозга убойного скота, гомогенизируют на волчке. Гомогенат заливают 10 частями 0,8% раствора хлорида натрия с добавлением 0,05% ЭДТА. Экстракцию проводят при 10^oC в течение 30 мин при постоянном встряхивании. Центрифугируют взвесь ткани мозга в течение 25 мин на рефрижераторной центрифуге при 15^oC со скоростью 9000 об. /мин, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость дважды насыщают сульфатом аммония при 18^oC. Первым 9% насыщением сульфатом аммония осаждают высокомолекулярные белки, которые отделяют фильтрованием и отбрасывают. Вторым 39% насыщением осаждают биологически активное вещество. Осадок формируют 1-1,5 часа при 18^oC и получают фильтрованием через мелкопористый фильтр. Полученный осадок растворяют в 0,85% растворе хлорида натрия, обессоливают, хроматографируют и леофилизуют чистое вещество. Выход активного вещества составляет 50 мкг, т.е. 500 мкг на 1 кг сырья.

Пример 2. Берут 100 г свежего или замороженного спинного мозга животного, гомогенизируют на волчке. Гомогенат заливают 15 частями 0,9% раствора хлорида натрия с добавлением 0,0% ЭДТА. Экстракцию проводят при 10^oC в течение 30 мин при постоянном встряхивании. Центрифугируют взвесь ткани мозга в течение 30 мин на рефрижераторной центрифуге при 5^oC со скоростью 6000 об. /мин, осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость дважды насыщают сульфатом аммония при 10^oC. Первым 9% насыщением осаждают высокомолекулярные белки, которые отделяют фильтрованием и отбрасывают. Вторым 39% насыщением сульфатом аммония осаждают биологически активное вещество. Осадок формируют 1,5 часа при 10^oC и получают фильтрованием на мелкопористом фильтре. Полученный осадок растворяют в 0,85% растворе хлорида натрия, обессоливают, хроматографируют и леофилизуют чистое вещество. Выход активного вещества составляет 50 мкг, т.е. 500 мкг на 1 кг сырья.

Пример 3. Берут 100 г свежего или замороженного спинного мозга животного, гомогенизируют на волчке. Гомогенат заливают 15 частями 1% раствора хлорида натрия с добавлением 0,05% ЭДТА. Экстракцию проводят при 15^oC в течение 30 мин при постоянном встряхивании. Центрифугируют взвесь ткани мозга в течение 25 мин на рефрижераторной центрифуге при 10^oC со скоростью 8000 об./мин. Осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость дважды насыщают сульфатом аммония при 15^oC. Первым 9% насыщением сульфатом аммония осаждают высокомолекулярные белки, которые отбрасывают после фильтрования. Вторым 39% насыщением осаждают биологически активное вещество. Осадок формируют в течение 1 часа при 15^oC и получают фильтрованием через мелкопористый фильтр. Полученный осадок растворяют в 0,85% растворе хлорида натрия, обессоливают, хроматографируют и леофилизуют чистое вещество. Выход активного вещества составляет 50 мкг, т.е. 500 мкг на 1 кг сырья.

Таким образом, предлагаемый способ исключает применение токсичного и взрывоопасного реагента хлороформа, вредно влияющего на окружающую среду, нетрудоемок, экономичен, сокращает время экстрагирования и позволяет получить биологически активное вещество высокой степени чистоты.