способ получения плазмиды, кодирующей активатор плазминогена

Формула изобретения

1. Способ получения плазмиды, кодирующей активатор плазминогена, включающий гидролиз с помощью рестриктаз векторной молекулы ДНК, встраивание в нее фрагментов ДНК, несущих структурный ген активатора плазминогена и регуляторные области, отличающийся тем, что проводят гидролиз векторной плазмиды pBR 322 с помощью EcoR I и Hind III рестриктаз, осуществляют последовательное встраивание синтетического нуклеотида, содержащего последовательность Шайн Далгарно, стартовый кодон, имеющего последовательность нуклеотидов, представленную в описании на фиг. 3, далее в синтетическую последовательность встраивают два следующих друг за другом терминатора транскринции trp А-терминатор и/или tet A/orf терминатор из Tn_n10, после этого встраивают структурный ген активатора плазминогена последовательностью нуклеотидов, представленной в описании на фиг.26 и 27 trp-промотор со следующей последовательностью нуклеотидов:



или Тас-промотор из плазмиды ptacSDT(DSM 5018).

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что из плазмиды pBR 322 предварительно удаляют Nde I Pvu II фрагмент ДНК, содержащий nic/bom область.

3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что из плазмиды pBR 322 предварительно удаляют EcoR V Nru I фрагмент ДНК, содержащий часть гена, обеспечивающего устойчивость к тетрациклину.

4. Способ по пп.1 3, отличающийся тем, что структурный ген встраивают последовательно.

5. Способ по пп. 1 3, отличающийся тем, что для удлинения расстояния между последовательностью Шайн Далгарно и стартовым кодоном проводят гидролиз плазмиды рестриктазой Nde I, достраивают место разреза с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I и лигируют место разреза ДНК-лигазой.

Описание изобретения к патенту

При терапии, обусловленной фибрином закупорки сосудов, например, инфаркта сердца, эмболии легких, артериальных сосудистых заболеваний конечностей и др. активаторы плазминогена играют существенную роль. С начала 50-х годов известно, что превращение плазминогена обусловлено его преобразованием в плазмин, т.е. в энзим, который обусловливает расщепление фибрина в растворимые полипептиды и, таким образом, растворение обусловленных фибрином тромбов. Этот активатор плазминогена был назван урокиназой, и оказалось, что в действительности существуют различные формы урокиназы. Все эти формы получаются, однако, непосредственно из одной молекулы-предшественника известного приблизительно с середины 70-ых годов цимогена проурокиназы. Тогда было установлено, что эта проурокиназа обладает одноцепочечной структурой, и она была названа "scu-PA" (single chain urinary plasminogen aktivator). Scu-PA cостоит из 411 аминокислот и гликолизирован в природной предшествующей форме до аминокислоты 302.

Из различных работ известно генотехнологическое получение негликозилированной части протеина scu-PA, который назван "rscu-PA" (рекомбинированный sсu-PA) или имеет также тривиальное название "саруплаза". При терапевтическом использовании rscu-PA оказалось, что его наблюдаемое действие и совместимость превосходят употребительные фибринолитики (см. Ланцет, 1989, с. 863-868).

Для получения негликозилированного активатора плазминогена rscu-PA использовали прокариоты, о чем уже существовали некоторые данные в литературе. Известные до настоящего времени способы получения scu-PA основаны на экспрессии структурного гена scu-PA, выделенного из человеческих тканей. К сожалению, при этом достигается лишь незначительная степень экспрессии, которая не обеспечивает экономичного получения целевого продукта в больших количествах. Так, например, описанное Hibino и др. в "Agric. Biol. Chem.", 52, 329-336 (1988) получение rscu-PA в E.coli дает степень экспрессии лишь 2% измеренную в общем количестве белка бактерий. С другой стороны, в европейской заявке на патент N 92182 А2, а также Holmos и др. достигаемую степень экспрессии точно не указывают. Однако при проверке этих данных в различных штаммах было получено менее 2% протеина бактерий rscu-PA.

Следует указать на то, что в большинстве случаев экспрессии эукариотного протеина в бактериях получается также rscu-PA в клетке в качестве денатурированного включенного тела, которое далее называется протеином предварительной стадии, который после промежуточного выделения должен быть протеинохимически возвращен к правильной четвертичной структуре rscu-PA. Полученный таким образом продукт можно затем перевести для определения образовавшегося количества rscu-PA, например добавлением плазмина, в двухцепочечную негликозилированную урокиназу (rtcu-PA), энзимная активность которой определена и может служить мерой образовавшегося количества rscu-PA. Естественно, можно определять выход протеина предварительной стадии или rscu-PA и, таким образом, степень экспрессии, например, с помощью денситометрической оценки гелевого электрофореза всего протеина.

Неожиданно было обнаружено, что бактерии, трансформированные плазмидами, полученными в соответствии с изобретением, дают во много раз большую степень экспрессии, чем штамм-хозяин, идентично трансформированный плазмидами, известными из способа уровня техники. Полученные в соответствии с изобретением плазмиды в соответствии с этим более пригодны, чем все известные до настоящего времени плазмиды, для получения rscu-PA или его протеина предшествующей стадии. Следует еще упомянуть, что известным образом может быть получен также с помощью уже упомянутого выше для аналитических целей расщепления rscu-PA, например плазмином, также и rscu-PA в технических масштабах, после чего благодаря предложенному изобретению очень доступен rscu-PA.

Плазмиды, получаемые в соответствии с изобретением, отличаются, кроме того, тем, что их оперон имеет регулируемый в соответствующем случае синтетический промотор, активную в качестве места связи рибосом последовательность Шино-Дальгарно, стартовый кодон, синтетический структурный ген для scu-PA и противоположный расположению структурного гена по крайней мере один терминатор. Предпочтительно имеют место один за другим следующие терминаторы, в случае которых речь идет в частности о trpA терминаторе и/или о tetA/orfl терминаторе из Tn 10 (см. Schollmeier и др.).

В случае регулируемого промотора речь идет, в частности, о промоторе или trp-промоторе.

В контрольном регионе полученные в соответствии с изобретением плазмиды имеют расстояние между последовательностью Шино-Дальгарно и стартовым кодоном 6-12, предпочтительно 8-10 нуклеотидов.

При конструировании использованного в новых плазмидах структурного гена предпочтительно встраивают закодированные для соответствующих аминокислот приведенные ниже базовые последовательности. При этом в структурном гене не должны быть выполнены одновременно все эти отличительные признаки.

Аминокислота Триплет

Аргинин CGT

Лейцин CTG

Валин GTT

Пролин CCG

Глицин GGT

С другой стороны, при построении структурного гена целесообразно, по возможности, избегать применения следующего кодона для соответствующих названных аминокислот (причем снова не должны выполняться одновременно эти отличительные признаки для всех аминокислот).

Кодон, которого следует избегать Аминокислота

АТА Изолейцин

GTC Валин

ССС Пролин

AAG Лизин

AGG, AGA, CGG, CGA Аргинин

GGA, GGG Глицин

Путем выбора кодона в соответствии с изобретением для отдельных аминокислот в структурном гене, а также вышеназванных отличительных признаков контрольного гена, полностью препятствуют образованию стабильных вторичных структур между структурным геном и контрольным регионов.

Для получения синтетического структурного гена сначала синтезируют олигонуклеотиды в отрезке 40-80 оснований в одну цепочку. Целесообразно получать их в масштабе 1 мкм/моль по методу твердых фаз по Адамсу и др. с помощью ДНК-синтезатора модели "Biosearch 8600" фирмы "New Brunswick Scient". В качестве мономерного синтона применяется при этом имеющийся в продаже -цианоэтилзамещенные диизопропиламино-фосфорамидиты соответствующих необходимых дезоксирибонуклеозидов. После отщепления относителя находящиеся на концах еще тритилзамещенные нити обессоливаются в стерильных условиях путем гельфильтрации и предварительно очищаются, и затем в две стадии подвергаются первому разделению с помощью "возвратной фазы" HPLC. Соответствующий основной продукт детритилируют, и после двух дополнительных стадий очистки "возвратной фазы" HPLC получают целевой олигонуклеотид высокой чистоты, как показал гельэлектрофорезный анализ (PAGE).

Из группы 4-9 этих отдельных нитей получали затем длиной около 200 нуклеотидов фрагменты двойных цепей, чтобы неконцевые, отдельные олигонуклеотиды у 5"-конца фосфорилировать и соответствующие комплементарные нити вместе с концевыми олигонуклеотидами ренатурировать и лигировать. После лигации образовавшиеся способные к клонированию двойные цепные фрагменты используют затем в подходящих линеаризированных векторах. Дополнительные меры можно узнать из нижеприведенных примеров.

Используемые сокращения имеют следующие значения:

бп основные пары;

ДЕ 52 анионообменник фирмы Ватман;

ЕДТК этилендиаминтетраукасусная кислота;

ИПТГ изопропил-b-D-тиогалактопиранозид;

ПАГЕ полиакриламидгельэлектрофорез;

PU Ploug untis;

НДС натрийдодецилсульфат;

Ш.Д.-последовательность: Шине-Дальгарно последовательность;

Трис-HCl гидрохлорид трисгидроксиметиламинометана;

Твин-80 полиэтиленоксид (20) сорбитанмоноолеат.

Для конструирования в соответствии с изобретением новых плазмидов предпочтительно исходят от имеющейся в продаже плазмиды pBR (4363 бп). Предпочтительно из него элиминируют nic/bom область и/или тетрациклиновый резистентный ген. При этом нет необходимости полностью удалять ген резистентности к тетрациклину, чаще всего достаточно, чтобы плазмида не передала трансформированному таким образом штамму бактерии устойчивости к тетрациклину. С помощью этих мер (удаление nic/bom области и, к тому же, части гена резистентности к тетрациклину) получают так называемую "высоконадежную плазмиду".

Предпочтительной стратегией для конструирования новой плазмиды в соответствии с изобретением, исходя из модифицированной, как упоминалось выше, плазмиды pBR 322 (или другой названной известной ранее плазмиды), является в качестве последующей стадии встраивание синтетического "сайта мультиклонирования" между местом разреза Eco RI и Hind III. Этот сайт мультиклонирования (см. фиг. 3) имеет установленную последовательность мест разреза, лежащие между ними основания являются произвольно выбранными, за исключением последовательности между Hba I и Nde I, которые содержат места связи рибосом (Шине-Дальгарно-последовательность) из Hyl-оперона-5"-AAGGAG-3"(4) B.subtilis, а также установленного расстояния между Ш.Д.-последовательностью и стартовым кодоном ATG. Следующие за Ш.Д.-последовательностью основания GAAAT перенесены из (4) и связаны с CATATG, местом разреза Nde I. Таким образом, расстояние между Ш.Д.-последовательностью и ATG составляет 8 основных пар. Расстояния между отдельными местами разреза сайта мультиклонирования должны быть из соображений технологии клонирования по меньшей мере около 20 нуклеотидов, в результате чего облегчается удаление промежуточных фрагментов.

С помощью этого сайта мультиклонирования в плазмиду вводят места разреза, которые (целесообразно после встраивания терминатора транскрипции) делают возможным следующее друг за другом успешное встраивание частичной последовательности scu-PA структурного гена, предпочтительно начинающегося от С-конца целевого протеина, т. е. от 3"-конца нити ДНК получающегося структурного гена, а также встраивания, например, синтетического или также выделенного из другой плазмиды или имеющегося в продаже trp-промотора. Полная нуклеотидная последовательность полученного таким образом scu-PA структурного гена представлена с указанием аминокислот, соответствующих отдельному кодону, на фиг. 26 и 27.

Другие новые плазмиды могут быть получены в соответствии с изобретением из сконструированной, как описано выше, плазмиды. Например, путем разреза с помощью Eco RI и Hind III получают синтетический scu-PA структурный ген со всеми единицами регулирования и затем встраивают в другой, в энтеробактерийную, в частности E.coli, автономно множащуюся плазмиду, который, к тому же, линеаризируют или укорачивают с помощью разреза с помощью Eco RI и Hind III. Таким же в принципе способом, но при использовании места разреза Eco RI и Xba I можно заменить также, например, trp-промотор taс-промотором (и наоборот) в полученной в соответствии с изобретением плазмиде.

Аналогично можно исходить также из других известных плазмид, которые обладают единственным местом разреза Eco RI и Hind III, например рис. 9, 12, 13, 18, 19 и др.

Новые плазмиды с увеличенным расстоянием между Шино-Дальгарно-последовательностью и стартовым кодоном ATG можно получить в соответствии с изобретением тем, что сконструированная, как описано выше, плазмида, в которой упомянутое расстояние составляет например, 8 нуклеотидов, разрезают Nde I, которое заполняет полученное место разреза, и непосредственно после этого полученные концы лигируют, в результате чего образуется желаемая новая плазмида, в которой расстояние между Ш.Д.-последовательностью и стартовым кодоном составляет, например, 10 нуклеотидов.

Как уже было сказано, с бактериями, трансформированными плазмидами, полученными в соответствии с изобретением, может быть достигнута во много раз большая степень экспрессии, чем в случае известных из уровня техники плазмид. Трансформацию подходящих компетентных организмов-хозяев осуществляют известным образом. Для экспрессии полученных в соответствии с изобретением плазмид особенно пригодны организмы-хозяева штамма типа E.coli и применяемые энтеробактерии, например штамм Pseudomonas, salmonella, Enterobacter, Klebsiella или Serratia.

Предпочтительными организмами-хозяевами являются штаммы типа E.coli, например E.coli GRT-1 и, в частности, штаммы E.coli подгруппы К12 как, например, E. coli K12 IM101 /ATCC 33876/, E.coli K12 IM103 /ATCC 39403/, E.coli K12 IM105 /DSM 4162/, E.coli K12 ATCC 31446 или также E.coli K12 DHI /ATCC 33849/.

Введение экспрессии в экспрессионную систему E.coli, которая содержит taс-промотор, можно осуществлять, например, путем добавления лактозы или отбора глюкозы, но предпочтительно путем добавления изопропил-b-D-тиогалактопиранозида. Однако если в плазмиде имеется trp-промотор, то индукцию осуществляют предпочтительно с помощью индолакрилуксусной или индолакрилпропионовой кислоты. Другие известные индукторы, само собой разумеется, могут быть также использованы.

После индукции и достижения определенной вышеуказанной плотности клетки, клетки отделяют центрифугированием, и остаток после центрифугирования после суспендирования в водном солевом растворе переводят, например, в гомогенизатор, в котором клетки в результате разницы давлений подводят к месту. После нового центрифугирования получают в остатке протеин предварительной стадии rscu-PA наряду с водонерастворимыми обломками клеток и пр. В результате обработки раствором гидрохлорида гуанидина протеин предварительной стадии переходит в раствор, и после нового центрифугирования отстоявшийся раствор обрабатывают редокс-системой (например содержащей восстановленный или окисленный глутатион), в результате чего осуществляется образование естественной конформации, т. е. образование целевой rscu PA. Она находится затем в реакционной смеси в растворенной форме и может быть выделена в чистом виде в результате обычных стадий очистки (например, хроматографии и последующего высушивания замораживанием).

Для аналитических целей целесообразно ферментировать трансформированные подлежащим исследованию плазмидой штамм Е.coli и после достижения вышеуказанной оптимальной плотности суспензии клетки индуцировать подходящим индуктором экспрессию rscu-PA-протеина предварительной стадии. После соответствующей продолжительности ферментации отбирают аликвотные части, и отцентрифугированные из них клетки растворяют затем лизоцимом (1 мг лизоцима на мл 50 ммоль буфера трисгидролорида с рН 8,0, 50 ммоль этилендиаминтетрауксусной кислотой и 15% сахарозы). Гомогенат лизированных клеток солюбилизируют в 4-5 моль растворе гуанидингидрохлорида и после разбавления до 1,2 моль гуанидин-гидрохлорида при добавлении восстановительного средства (глутатиона, меркаптоэтанола или гистеина) за 2-5 часов подвергают реакции обратной (см. также, например, Винклер и др.). Полученную таким образом одноцепную rscu-PA при добавлении плазмиды превращают в двухнитевую rscu-PA, активность которой определяется с помощью субстрата S 2444 (пироГлю-Гли-Арг-п-нитроанилид); Каби диагностика Швеция, который отщепляется только от двухнитевой активной урокиназы. Это активирование rscu-PA плазмином осуществляют в 50 ммоль трис-буфере, 12 ммоль хлористого натрия, 0,02% твина-80 при рН 7,4 и 37^oC. Соотношение rscu-PA к плазмину должно составлять приблизительно (100-1500):1, считая на молярность, или приблизительно (8000-36000):1, считая на энзимную единицу. Тестовую инкубацию проводят в 500 ммоль трис-буфера, 38 ммоль хлористого натрия при рН 8,8 в присутствии 0,36 мкммоль апротинина (для торможения плазмина) и 0,27 ммоль S 2444 при 37^oC. В зависимости от содержания пробы rscu-PA реакцию после 5-60-минутной инкубации останавливают путем добавления 90%-ной уксусной кислоты и измеряют экспрессию при 405 нм. По указанию изготовителя субстрата S 2444 в случае этой предварительной стадии изменение экстинкции означает 0,05 в минуту при 405 нм активности 25 PU/мл тестового раствора.

Выходы rseu-PA, полученные из протеина предварительной стадии, полученные при применении различных изготовленных в соответствии с изобретением плазмид в различных бактериях, приведены на фиг. 10, 12 и 14.

Как видно из фиг. 11, а также из данных нижеприведенных примеров, в частности таблицы 1 примера 2, плазмиды, получаемые в соответствии с изобретением, осуществляют предпочтительно в штаммах E.coli образование rscu-PA протеина предварительной стадии со степенью экспрессии от 10 до 25 мас. в частности 14-20 мас. образовавшегося общего протеина. Степень экспрессии, следовательно, при применении новых плазмид может быть достигнута, по крайней мере, в 10-15 раз выше, чем в случае известных плазмид, например pUK 54 trp 207-1.

На фиг. 1 и 2: показан конструкция плазмиды pBF 158 из имеющейся в продаже плазмиды pBR 322. При этом удалялись последовательно nic/bom-область и большая часть гена резистентности к тетрациклину.

На фиг. 3 нуклеотидная последовательность синтетического "сайта мультиклонирования".

На фиг. 4 конструкция плазмиды pBF 158-01. Изображено введение синтетического сайти мультиклонирования в плазмиду pBF 158 между местами разреза Eco RI и Hind III.

На фиг. 5 конструкция плазмида pBF 158-01 T. Фрагмент Cla I x Hind III заменяют соответствующим фрагментом "Т" из плазмиды pRT 61, на котором находится tet A/orfL терминатор из Tn 10.

На фиг. 6-12 нуклеотидные последовательности синтетических фрагментов гена, кодированного для человеческой scu-PA, их введение при образовании структурного гена для scu-PA в плазмиду в соответствии с изобретением, исходя из плазмиды pBF 158-01 Т, описанной в примерах 1г-1е и изображенной на фиг. 13-18 и 20.

На фиг. 13-15 конструкция плазмиды pBF 158-02 T-pBF 158-06 Т с помощью введения олигонуклеотидного фрагмента М4-М8, исходя из С-конца целевого протеина (соответственно 3"-конца нити ДНК), начиная с плазмиды pBF 158-01 Т.

На Ффг. 16-18 конструкция плазмиды pBF 158-08 Т через вспомогательную конструкцию в плазмиде рис. 19 (см. пример 1b).

На фиг. 19 нуклеотидная последовательность синтетического типа trp-промотора.

На фиг. 20 конструкция экспрессионной плазмиды для протеина предварительной стадии человеческого rscu-PA, pBF 160. Структурный ген для scu-PA изображен с помощью черной толстой линии между местами разреза Nde I и Cla I.

На фиг. 21 степень экспрессии протеина предварительной стадии человеческого rscu-PA (определена в виде активности rtcu-PA по обратной реакции и активированию) в различных трансформированных плазмидой pBF 160 или плазмидой pUK 54 trp-207-1 (10) штаммов E.coli при контроле trp-промотора в зависимости от времени после индукции с индолакриловой кислотой к моменту времени 0. Указаны определенные с помощью субстрата S 2444 rtcu-PA-активности в PU на мл ферментационной среды с оптической плотностью, равной 1 при 578 нм.

На фиг. 22 денситограмма SDS-RAGE протеинов из трансформированного с помощью pBF 161 E.coli K12 IM103-клеток после ферментации пред (А) и 6 часов после (В) добавления индолакриловой кислоты в качестве индуктора.

На фиг. 23 степень экспрессии протеина предварительной стадии человеческого rscu-PA (определенного в виде rtcu-PA-активности после обратной реакции и активирования) в E.coli K12 IM103, трансформированного с помощью pBF 171, т.е. при контроле tac-промотора. Индукцию осуществляли к моменту времени 0 с изопропил--D-тиогалактопиранозидом. Указаны определенные rtcu-PA-активность по отношению к субстрату S 2444 в PU на мл ферментативной среды с оптической плотностью, равной 1 при 578 нм.

На фиг. 24 увеличение расстояния между Ш.Д.-последовательностью и стартовым кодоном ATG от 8 до 10 баз с помощью наполнения Nde I местом разреза и последующей лигацией соответствующих тупых концов.

На фиг. 25 степень экспрессии протеина предварительной стадии человеческого rseu-PA (определенной в виде rtcu-PA-активности после обратной реакции и активирования) при контроле trp-промотора в E.coli GRT-I, трансформированном плазмидой pBF 161 или pBF 163 (-----). Индукцию осуществляют с андолактиловой кислотой непосредственно после момента времени 0. Указаны определенные с субстратом S 2444 rtcu-активности в PU на мл ферментативной среды с оптической плотностью, равной 1 при 578 нм.

На фиг. 26 и 27 полная нуклеотидная последовательность scu-PA-структурного гена с указанием аминокислот, соответствующих отдельному кодону.

Реакционные системы, применяемые в примерах на осуществление способа, являются употребительными, имеющимися в продаже (см. например: Nachr. Chem. Techn. Lab. 35, 939, 1987).

Используемая в примерах для селекции клонов культурная среда содержит на литр: 7,8 г пептона из рыбы, 7,8 г пептона из казеина, 10 г дрожжевого экстракта, 5,6 г хлористого натрия, 10 г глюкозы. Эту среду смешивают с 10 г агара на литр в тепле и выливают на пластины.

Пример 1. Конструирование экспрессионной плазмиды pBF 160 для протеина предварительной стадии rscu-PA с синтетическим scu-PA-геном при контроле trp-промотора.

а) Конструирование плазмиды pBF 158.

i) Из плазмиды pBF 322 (Фармацея, N 27-4902, 4363 бп) вырезают nic/bom-область, которая находится между основаниями и 2263, удаляют (см. также рис. 1), как следует ниже: pBR 322 у основания 2298 с Nde I, и таким образом линеаризируют. Выступающие концы наполняют путем реакции "заполнения", и таким образом получают тупые концы. После этого у основания 2068 разрезают с помощью Pvu II, и оба тупых конца оставшейся части pBR 322 с помощью обычной техники снова лигируют с помощью Т4-лигазы. Непосредственно после этого лигационная вставка в соответствующих E.coli K12 IM103 клетках (АТСС 39403) трансформируется. Трансформированные клетки культивируют на среде при добавлении 150 г ампициллина/мл. Из полученных клонов выбирают такие, которые содержат плазмиду pBF 157, которая отличается от исходной плазмиды pBF 322 на 228 нуклеотидов а) Pst I x BspM II, б/Pst I x Bal I-, в/Pst I x Ava I-фрагменты. Оба единственных места разреза Pvu II и Nde I pBR 322 более не содержатся в плазмиде pBF 157.

ii) Из pBF 157 удаляют большую часть тетрациклиновой последовательности путем разреза с помощью Eco RV x Nru I и последующей лигации появившихся тупых концов. После трансформации E.coli K12 IM103 и культивирования на среде со 150 г ампициллина/мл получают клоны, из которых выбирают те, которые содержат плазмиду pBF 158. Она на 787 ануклеотидов короче, чем pBF 157, и отличается, кроме того, отсутствием места разреза Bam HI. Трансформация штаммов бактерий с помощью pBF 158 не придает им резистентности к тетрациклину.

b) Конструирование pBF 158-01, введение синтетического мультиклонирующего сайта.

Из pBF 158 путем разреза с помощью Ero RI x Hind III удаляют фрагмент, величиной 31 нуклеотид и в люк лигируют синтетический сайт мультиклонирования, последовательность которого изображена на фиг. 3. После трансформации лигационной вставки в E.coli K12 IM103 и культивирования на среде со 150 г ампициллина/мл выбирают те клоны, которые содержат плазмиду pBF 158-01. Она отличается от pBF 158 дополнительными единственными местами разреза Xba I, Nde I, Sae I, Eag I, Kpn I, Spe I, а также вторым местом разреза Pst I (фиг. 4).

с) Конструирование pBF 158-01 T, введение транскрипционного терминатора.

Из pBF 158-01 удаляют фрагмент Cla I x Hind III сайта мультиклонирования и заменяют Cla I x Hind III фрагментом из pRT 61, на котором находится tlt A/ort L терминатор из Tn 10.

После трансформации в штамме E.coli K12 IM103 и культивирования на среде со 150 г ампициллина/мл выбирали те клоны, которые содержали плазмиду pBF 158-01 T. Она отличается от pBF 158-01 фрагментом Cla I x Hind III, большим на 297а нуклеотидов (фиг. 5).

d) Введение синтетического фрагмента М4-М8 для scu-PA-гена, конструкция плазмидов pBF 158-02 T-pBF 158-06 Т.

Все синтетические фрагменты описаны на фиг. 5а-5g. Они вводятся в соответствующие векторы в качестве приблизительно двойных жгутовых фрагментов длиной 200 нуклеотидов. Для этого векторы разрезают остаточными энзимами, соответствующими названным местам разреза, и с помощью электрофореза на агарозном геле, электроэлюирования и очистки отделяют через ДЕ 52 от подлежащего удалению фрагмента. После этого осуществляют лигирование относящимся к нему синтетическим фрагментом двойной цепи с помощью Т4-лигазы, трансформации в E. coli K12 IM103 (фиг. 13-15) и селекции на среде, содержащей ампициллин.

i) Лигирование фрагмента М 8 между Bam HI и Gla I в плазмиду pBF 158-01 T.

Появляется плазмида pBF 158-02 T.

Одигонуклеотид 019 кодирует для С-терминальной последовательности scu-PA. За стоп-кодоном ТАА находится место разреза Nhe I, распространяющееся от дополнительной последовательности транскрипционной trpa-терминатора до Cla I.

ii) Лигирование фрагмента М 7 между Spe I и Bam HI в плазмиду pBF 158-02 Т.

Получается плазмида pBF 158-03 Т.

iii) Лигирование фрагмента М6 между Kpn I и Spe I в плазмиду pBF 158-03 T.

Получается плазмида pBF 158-04 T.

iv) Лигирование фрагмента М 5 между Eag I и Kpn I в плазмиду pBF 158-04 Т.

Получается плазмида pBF 158-05 T.

v) Лигация фрагмента М4 между Sac I и Eag I в плазмиду pBF 158-05 Т.

Получается плазмида pBF 158-06 Т.

Из полученных клонов i-v выбирают соответственно те, которые отличаются от соответствующего предшественника наличием введенного нового фрагмента в дополнительно проверенной правильной последовательности.

е) Введение синтетических фрагментов М 2 и М 3 для seu-PA-гена. Конструирование pBR 158-08 Т.

Так как для введения фрагментов М 2 и М 3 необходим Pst-I-разрез и на используемой для этого плазмиде pBF 158 находится еще Pst-I место разреза (в ампициллиновой последовательности), которое мешало бы при последующем клонировании, поступают следующим образом (фиг. 16-18).

i) Из имеющейся в продаже (например, "Pharmacia") плазмиды (рис. 19) удаляют сайт мультиклонирования и дополнительно 212 нуклеотидов вверх от Nde I x Hind III фрагмента. В полученном пропуске затем лигируют синтетический сайт мультиклонирования из плазмиды pBF 158-04-3 Т в виде Nde-I x Hind III-фрагмента. Эту плазмиду pBF 158-04-3 Т получают из плазмиды pBF 158-02 Т (см. пример 1 di) путем введения олигонуклеотидного фрагмента М 6 и соответствующей плазмиды pBF 158-04 Т без фрагмента М 7. После трансформации в E. coli K12 IM103 клеток и культивирования на среде со 150 г ампициллин/мл выбирают те клоны, которые содержат плазмиду рис. 19-04-3. Она отличается от рис. 19 наличием фрагмента Nde I x Hind III длиной 712 нуклеотидов.

ii) Из рис. 19-04-3 удаляют фрагмент Pst I x Sae I, выделяют линеаризированный вектор, и лигируют олигонуклеотидный фрагмент М 3. После трансформации в E.coli K12 IM103 и культивирования на среде с 150 г ампициллина/мл выбирают те клоны, которые содержат плазмиду рис. 19-07. Она отличается от рис. 19-04-3 фрагментом Pst I x Sae I длиной 189 нуклеотидов, который содержит фрагмент М 3 с правильной последовательностью.

iii) Из вышеописанной плазмиды рис. 19-07 удаляют фрагмент Nde I x Ast I и в пропуск лигируют фрагмент М 2. После трансформации в E.coli K12 IM103 и культивирования на среде с 150 г ампициллина/мл, выбирают те клоны, которые содержат плазмиду рис. 19-08. Она отличается от рис. 19-07 наличием фрагмента Nde I x Pst I длиной 246 бп (М2) с правильно дополнительно проверенной последовательностью.

iv) Из плазмиды фиг. 19-08 удаляют фрагменты М 2 и М 3 в виде Nde I x Sae I фрагмента и лигируют в полученную после разрезов с помощью Nde I x Sae I большую часть pBF 158-06 T. После трансформации в E.coli K12 IM103 и культивирования на среде со 150 г ампициллина/мл выбирают те клоны, которые содержат плазмиду pBF 158-08-T. Она отличается от pBF 158-06 Т наличием фрагмента Nde I x Sae I длиной 435 нуклеотидов.

I) Конструирование плазмиды pBF 160, введение синтетического trp-промотора.

Уже известная последовательность trp-промотора распространяется до Xba I места разреза и удлиняется у 5"-конца с помощью последовательности 5"ААТТЦТГАААТ-3". В результате этого конструируют Eco RI место разреза (фиг. 19, фрагмент М1). Отдельные нити 021 и 021 А ренатурируют и лигируют в плазмиду pBF 158-08 T, разрезанную Eco RI x Xba I (фиг. 20). После трансформации в E. coli K12 IM103 и культивирования на среде со 150 г ампициллина/мл выбирают те клоны, которые содержат pBF 160. Плазмида pBF 160 отличается от всех вышеописанных предшественников тем, что штаммы бактерий, таким образом трансформированные E.coli, на добавление индолакриловой кислоты экспримируют протеин предварительной стадии rscu-PA.

g) Экспрессионный тест

i) Ферментация

Различные штаммы, E.coli, трансформированные с помощью плазмиды pBF 160, например E.coli GRT-I, E.coli K12 IM103, а также E.coli K12 ATCC 31446, при соответствующих одинаковых условиях ферментируют в среде, состоящей из 38 ммоль сульфата аммония, 56 ммоль фосфатного буфера рН 7,0, 1 ммоль сульфата магния, 1% дрожжевого экстракта, 1% глюкозы, содержащей 150 мг ампициллина на литр, и индуцируют с помощью 62 мг индолакриловой кислоты/л экспрессию протеина предварительной стадии rseu-PA. Для сравнения вышеназванные штаммы трансформируют с помощью вышеописанного плазмида, который содержит ген человеческой проурокиназы из банка кДНК, полученного из МРНК клеток Детройт 562 и имеющий обозначение pUK 54 trp 207-1, и затем при одинаковых условиях ферментируют и подвергают индукции.

Перед индукцией и каждый час после индукции, всего 6 часов, соответственно центрифугируют 1 мл клеточной суспензии с оптической плотностью (ОП) 1 при 578 нм и используют для тестирования степени экспрессии.

II) Обратная реакция протеина предварительной стадии до rscu-PA, его расщепление до rtcu-PA и измерение активности.

Отделенные центрифугированием клетки, как описано выше, соединяют с лизоцимом и затем используют гомогенат лизированных клеток для определения активности, как описано выше.

Степени экспрессии, определенные таким образом после измерения активности rtcu-PA, образованной из rscu-PA, получены из протеина предварительной стадии, представлены на фиг. 21. Отсюда видно, что штаммы E.coli, которые были трансформированы с помощью плазмиды pBF 160, дают 10-15-кратный выход эксперссии по сравнению с известными из литературы такими же штаммами E.coli, трансформированными с помощью плазмиды pUK 54 trp 207-1. Кроме того, оказалось, что выходы экспрессии во всех штаммах в зависимости от используемой для трансформации плазмиды лежат приблизительно при одинаковых значениях, т. е. что в частности штаммы (независимо от отдельных E.coli штаммов), трансформированные с помощью плазмиды pBF 160, всегда дают во много раз большую степень экспрессии, чем идентичные штаммы, трансформированные известной плазмидой pUK 54 trp 207-1.

Пример 2.

а) Конструирование экспрессионной плазмиды pBF-161 для протеина предварительной стадии rseu-PA с синтетическим scu-PA-геном при контроле trp-промотора.

Плазмид pBF 322 разрезали с помощью Eco RI и Hind III. Полученный фрагмент длиной 31 нуклеотид отделяли с помощью подготовительного электрофореза на агарозном геле. Оставшуюся часть pBF 322 элюировали с помощью электроэлюирования из геля и очищали с помощью хроматографии с помощью ДЕ 52.

Плазмиду pBF 160 (пример 11) также разрезают с помощью Еco RI и Hind III и фрагмент Eco RI x Hind III длиной 1684 нуклеотида, который содержит синтетический scu-PA-ген со всеми единицами регулирования (trp-промотор), отделяют с помощью электротрофореза на агарозном геле, элюируют, как описано выше, и очищают.

Полученные таким образом фрагменты лигируют обычным способом с помощью Т4-лигазы и затем трансформируют в E.coli K12 M103. После культивирования на среде со 150 г ампициллина/мл выбирают те клоны, которые содержат фрагмент Eco RI x Hind III длиной 1684 нуклеотида и продуцируют протеин rscu-PA предварительной стадии после добавления индолакриловой кислоты. Эти клоны содержат плазмид pBF 161.

b) Экспрессионный тест.

E.coli GRT-I, E.coli K12 IM103 и E.coli K12 ATCC 31 446 трансформируют с помощью pBF 161 и затем ферментируют, как описано в примере 1g, и испытывают результат экспрессии. Выходы rscu-PA протеина предварительной стадии определяют как rtcu-PA активность через 1-6 часов после индукции, и они сравнимы со значениями выходов, представленных на фиг. 21 для применения плазмида pBF 160 для трансформации.

Полученный по аналоги с примером 1 gi центрифугированием клеточный осадок может быть также включен путем кипячения в 0,25 моль трис-HCl-буфере, рН 8,0 с 4% натрийдодецилсульфата, 1% меркаптоэтанола и 20% глицерина. Растворенные таким образом протеины отделяют с помощью SDS-PAGG и делают видимыми с помощью окрашивания Кумассиблю. Окрашенные гели оценивают денсимметрически и интегрируют пятна среди пиков. Количество образовавшегося после индукции индолакриловой кислоты rseu-PA протеина предварительной стадии определяют с помощью субстракции пятен, идентифицированных в качестве протеина предварительной стадии полос перед индукцией, от полос, полученных после индукции. На фиг. 22 представлена диаграмма протеина, полученного из E.coli K12 M103 клеток. В вышеописанном примере количество rscu-PA протеина предварительной стадии после индукции составляет 17,9 мас. бактериального общего протеина. Другие примеры указаны в таблице.

Пример 3. Конструирование экспрессионной плазмиды для протеина предварительной стадии rscu-PA с синтетическим scu-PA-геном при контроле trp-промотора в pBR 322 с делецией в генрезистентности к тетрациклину.

а) Конструирование плазмиды pBR 322 del.

Плазмиду pBR 322 разрезают с помощью Eco RV и Nru I. Полученный фрагмент величиной 787 нуклеотидов удаляют с помощью агарозегельэлектрофореза, остаточное количество pBR 322 из геля элюируют с помощью электроэлюирования, очищают через ДЕ 52 тупые концы pBR 322 Eco RV x Nru I остаточной части, и обычным образом лигируют с помощью Т4-лигазы. После трансформации в E.coli K12 IM103 и культивирования на среде со 150 г ампициллина/мл выбирают те клоны, из которых аликвотная часть после перенесения на среду с 25 г тетрациклина/мл на ней не вырастает, т.е. не обладает тетрациклиновой резистенцией. Клоны содержат плазмид pBR 322 del, который отличается от pBR 322 тем, что он на 787 нуклеотидов меньше и не может быть разрезан более с помощью Eco RV и Nru I.

b) Конструирование плазмиды pBF 162.

pBR 322 del разрезают с помощью Ero RV и Hind III. Полученный таким образом фрагмент длиной 31 нуклеотид отделяют с помощью препаративной агарозегельэлектрофореза, остаточную часть pBR 322 del элюируют с помощью электроэлюирования из геля и очищают ДЕ 52.

Таким образом, из pBF 160 получают фрагмент Eco RI x Hind III длиной 1684 нуклеотида, который содержит синтетический seu-PA-ген со всеми единицами регулирования (trp-промотор).

Оба фрагмента обычным образом лигируют Т4-лигазой и затем трансформируют в E.coli K12 IM103 клетки. После культивирования на среде со 150 г ампициллина/мл выбирают клоны, которые содержат фрагмент Eco RI x Hind III длиной 1684 бп и продуцируют после добавления 62 г индолакриловой кислоты/мл rscu-PA протеин промежуточной стадии. Эти клоны содержат плазмиду pBF 162.

с) Экспрессионный тест.

E. coli GRT-I трансформируют с помощью pBF 162 и затем ферментируют, как описано в примере 1g, и испытывают результат экспрессии. Выходы rseu-PA-протеина предварительной стадии определяют как rtcu-PA-активность 6 часов после индукции, которая составляет 1300 pU/мл клеточной суспензии с оптической плотностью 1 и сравнима со значениями выходов, представленных на рис. 10 для экспрессии после трансформации E.coli GRT-I с помощью плазмиды pBF 160.

Пример 4.

а) Конструирование экспрессионной плазмиды pBF 171 для протеина предварительной стадии rscu-PA с синтетическим scuPA-геном при контроле taс-промотора.

Плазмиду pBF 161 разрезают с помощью Eco RI и Xba I. Полученный фрагмент длиной 74 нуклеотида отделяют с помощью препаративного агарозегельэлектрофореза, остаточную часть плазмида элюируют с помощью электроэлюирования и затем очищают с помощью ДЕ 52.

Из плазмиды ptac SDT (DSM 5018) выделяют фрагмент Eco RI x Xba I, который содержит taс-промотор. Для этого разрезают ptaс SDT с помощью Eco RI x Xba I и фрагмент отделяют с помощью препаративного полиакриламидгелевого электрофореза. Фрагмент элюируют с помощью нагрева до 65^oC в аммонийацетат/SDS-буфере, рН 8,0 из механически измельченного полиакриламида и очищают многократной экстракцией фенола, который насыщен 1 моль трис-буфера, рН 8,0.

Оба полученных таким образом фрагмента обычным образом лигируют Т4-лигазой и затем трансформируют в E.coli K12 IM103. После культивирования на среде со 150 г ампициллина/мл выбирают те клоны, которые после добавления ИПТГ продуцируют rscu-PA-протеин предварительной стадии. Эти клоны содержат плазмид pBF 171.

б) Экспрессионный тест.

E. coli K12 IM103 трансформируют с помощью pBF 171 и затем ферментируют, как описано в примере 1g, и исследуют результат экспрессии. Индукцию осуществляют, однако, с помощью полиакриламидгелевого электрофореза (конечная концентрация 0,5 ммоль).

Выходы rscu-PA-протеина предварительной стадии, определенные в виде rtcu-PA активности через 1 6 часов после индукции, представлены на рис. 12. Они сравнимы со значениями выходов, представленных на рис. 10 для применения плазмиды pBF 160 в одинаковых штаммах E.coli.

Пример 5.

а) Конструкция экспрессионного плазмида pBF 172 для rscu-PA-протеина прдварительной стадии с синтетическим scu-геном при контроле taс-промотора в pBR 322 с делецией в гене резистентности к тетрациклину.

Плазмиду pBR 322 del (см. пример 3а) разрезают с помощью Eco RI x Hind III. Полученный фрагмент длиной 31 нуклеотид отделяют с помощью препаративного агарозогелевого электрофореза, остаточную часть pBR 322 del элюируют с помощью электроэлюирования из геля и затем очищают ДЕ 52.

Таким же образом получают из pBF 171 (пример 4а) фрагмент Eco RI x Hind III, который содержит синтетический scu-PA-ген со всеми единицами регулярности (tac-промотор).

Оба полученных таким образом фрагмента лигируют обычным образом Т4 лигазой и затем трансформируют в E.coli K12 IM103 клетки. После культивирования на среде со 150 г ампициллина/мл выбирают клоны, которые продуцируют в присутствии 0,5 ммоль ИПТГ rscu- PA-протеин предварительной стадии. Эти клоны содержат плазмиду pBF 172.

б) Экспрессионный тест.

E. coli K12 IM103 трансформируют с помощью pBF 172 и затем ферментируют, как описано в примере 1d, и исследуют результат экспрессии. Индукцию осуществляют, однако, с помощью ИПТГ (конечная концентрация 0,5 ммоль). Выходы rscu-протеина предварительной стадии определяют как rtcu-PA-активность 1-6 часов после индукции, и она составляет приблизительно 1100 pU/мл клеточной суспензии оптической плотности 1 и сравнимы со значениями выходов, представленными на фиг. 21 для применения плазмиды pBF 160 с тем же E.coli штаммом.

Пример 6.

Изменение расстояния между Ш.Д.-последовательностью и стартовым кодоном в экспрессионной плазмиде для rscu-PA-протеина предварительной стадии.

Стартовый кодон, ATG, описанный во всех конструкциях примеров 1-5, является составной частью Nde-I-места разреза-CATATG-Nde-I разрезает за первым А гексануклеотидную последовательность и дает 5"-концы, которые перекрывают два основания. Заполняют 3"-концы, т.е. конструируют тупые концы, и после этого снова лигируют так, что соответствующая последовательность удлиняется на основные пары. Одновременно удаляют Nde I-место. Как видно из фиг. 24, в представленном там примере расстояние от Ш.Д.-последовательности до стартового кодона удлиняется от 8 до 10 основных пар. В дальнейшем экспериментальное проведение поясняется в примере:

а) Конструкция плазмида pBF 163.

Плазмид pBF 161 разрезают с помощью Nde I, затем выступающие концы заполняют фрагментом Кленова полимеразы 1 ДНК (2). После этого ДНК лигируют обычным образом Т4-лигазой и затем трансформируют в E.coli K12 IM103. После культивирования на ампициллинсодержащей среде выбирают клоны, которые содержат плазмиду pBF 163. Она отличается от pBF 161 отсутствием I места Nde и дополнительным основанием -ТА- в области прежнего Nde-I-места (см. фиг. 24).

б) Экспрессионный тест.

E.coli GRT-I трансформируют с помощью плазмиды pBF 163 и затем ферментируют, как описано в примере 1g, и испытывают результат экспрессии. Выходы rseu-PA-протеина предварительной стадии, определенные после обратной реакции и активирования в виде rtcu-PA-активности на мл клеточной суспензии с оптической плотностью 1 через 1-7 часов после индукции 62 мл индолакриловой кислоты/л приведены на фиг. 25. Они сравнимы со значениями выходов, представленных на фиг. 21 для применения плазмиды pBF 160 в том же штамме E.coli.