способ определения мембранотоксичных свойств ксенобиотиков

Формула изобретения

Способ определения мембранотоксичных свойств ксенобиотиков, включающий исследование мембранных структур реагирующих клеток с последующим определением мембранотоксичных свойств исследуемого вещества, отличающийся тем, что исследования мембранных структур реагирующих клеток осуществляют путем постановки реакции спонтанного розеткообразования субпопуляциями иммунокомпетентных клеток, при этом через 24 час от момента введения внутрибрюшинно экспериментальному животному тестируемого ксенобиотика подсчитывают количество розеткообразующих клеток и при их увеличении относительно контроля определяют наличие мембранотоксичных свойств у ксенобиотиков.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно биомембранологии, и может быть использовано для тестирования мембранотоксичных ксенобиотиков в эксперименте.

Известен способ определения мембранотоксичных веществ путем регистрации ультрафиолетового излучения с выделением мембран in vitro.

Однако данный способ является трудоемким, длительным, предусматривает наличие дорогостоящего оборудования, а также не позволяет учесть совместное взаимодействие веществ.

Одновременно известен способ анализа субпопуляций иммунокомпетентных клеток экспериментальных животных и человека реакций спонтанного розеткообразования лимфоцитов с ксеногенными эритроцитами. Возникновение спонтанных розеток, состоящих из лимфоцита крысы и присоединенных к нему эритроцитов морской свинки в присутствии декомплементированной сыворотки морской свинки и недекомплементированной сыворотки морской свинки при определении тимус-зависимых и тимус-независимых иммунокомпетентных клеток соответственно, не носит антигенспецифического характера, а иммуноадгезия обусловлена взаимодействием мембранных структур реагирующих клеток.

Задачей изобретения является упрощение способа определения мембранотоксических свойств ксенобиотиков.

Поставленная задача осуществляется тем, что используют исследование реакции спонтанного розеткообразования лимфоцитов с ксеногенными эритроцитами до и после введения тестируемых веществ экспериментальным животным. Вывод о наличии или отсутствии мембранотоксичных свойств у исследуемого ксенобиотика делается на основании изменения качественных характеристик иммунокомпетентных клеток, что проявляется нарушением количественного соотношения в субпопуляциях лимфоцитов. Предварительно за 24 ч до забоя животных, внутрибрюшинно вводится тестируемое на мембранотоксичные свойства химическое вещество в исследуемой дозе; параллельно контрольной группе животных за 24 ч до забоя, внутрибрюшинно вводится растворитель тестируемого вещества в адекватной дозе, а другой контрольной группе животных за 24 ч до забоя внутрибрюшинно вводится заведомо известный своими мембранотоксическими свойствами ксенобиотик. Животные забиваются методом декапитации. Исследуемую кровь собирают в пробирки, содержащие свободный от консерванта гепарин (100 ед/мл). Гепаринизированную кровь разводят в соотношении 1:2 средой 199, осторожно наслаивают пастеровской пипеткой на разделяющий раствоp фиколла-верографина (плотность 1,077) в соотношении 2:1 в центрифужной пробирке, удерживаемой под углом 45^o, и сразу же центрифугируют при 15000 об/мин в течение 25 мин. Пастеровской пипеткой снимают плазму вместе с диффузным мутноватым слоем тромбоцитов, а затем отсасывают мононуклеарные клетки, образующие беловатый слой над разделяющим раствором. Переносят последние в центрифужные пробирки и отмывают в десятикратном объеме среды 199, центрифугируя при 1500 об/мин 10 мин дважды (для Т-лимфоцитов). Осадок ресуспендируют в 1 мл среды 199, подсчитывают количество жизнеспособных клеток в суспензии в камере Горяева при окраске трипановым синим и доводят количество клеток суспензии до 3 х 10⁶/мл среды.

Для выделения лимфоцитов из тимуса и селезенки животных эти органы выделяются сразу же после забоя животных путем проведения срединной стернотомии и срединной лапаротомии. Тимус и селезенку помещают в разные пробирки в питательную среду 199 в объеме 1,5 2 мл, ткань органов тщательно ресуспендируют первоначально ножницами, а затем пастеровской пипеткой. Прогомогенизированную таким образом ткань тимуса и селезенки фильтруют через один слой капроновой сетки, дважды отмывают средой 199 в десятикратном объеме при 1500 об/мин 10 минут. Осевшие в центрифужных пробирках клетки ресуспендируют в объемен 1 мл среды 199, подсчитывают количество жизнеспособных клеток в камере Горяева при окраске трипановым синим и доводят количество клеток в суспензии до 5 х 10⁶/мл среды для тимоцитов и 3 х 10⁶/мл среды для спленоцитов.

Для приготовления суспензии эритроцитов, вступающих в реакцию спонтанного розеткообразования с Т-лимфоцитами периферической крови и тимоцитами, дефибринированную кровь морской свинки (2 мл) трижды отмывают средой 199, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 мин. Из отмытых эритроцитов приготавливают 0,5%-ю суспензию в среде 199.

Для приготовления суспензии эритроцитов, вступающих в реакцию спонтанного розеткообразования со спленоцитами, дефибринированную кровь морской свинки (2 мл) трижды отмывают средой 199, центрифугируя при 1500 об/мин в течение 5 мин, из отмытых эритроцитов приготавливают 50%-ную взвесь в среде 199. гемолитическую сыворотку разводят по титру раствором хлорида натрия (0,15 моль/л). Смешивают в пробирке равные объемы 50%-ной суспензии эритроцитов и гемолитической сыворотки, разведенной по титру. Инкубируют смесь в термостате при +37^oС в течение 30 мин для сенсибилизации эритроцитов. После сенсибилизации эритроциты дважды отмывают средой 199 в десятикратном объеме, центрифугируя при 1000 об/мин 5 мин. Осадок ресуспендирют в среде 199 для получения 5%-ной взвеси.

Для получения недекомплементированной сыворотки морской свинки отделение сыворотки от сгустка крови производят центрифугированием в течение 15 мин при 3000 об/мин. Пастеровской пипеткой сыворотку отсасывают и приготавливают ее 1%-ный раствор в среде 199.

Для получения декомплементированной сыворотки морской свинки отделенную от сгустка крови сыворотку (путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 15 мин) помещают в термостат при +56^oC на 1 ч. Сыворотку сохраняют при -20^oC, размораживают непосредственно перед проведением реакции розеткообразования, перед употреблением разводя средой 199 1:5.

К 5%-ной взвеси сенсибилизированных эритроцитов, вступающих в реакцию со спленоцитами, добавляют равный объем недекомплементированной сыворотки морской свинки, разведенной 1:10. Инкубируют смесь при +37^oC в течение 30 мин, а затем дважды отмывают эритроциты и приготавливают их них 0,5%-ную взвесь в среде 199, разводя 1:10.

Постановка реакции Т-лимфоцитов периферической крови и ксеногенных эритроцитов: в пробирке смешивают равные объемы (по 0,5 мл) суспензии лимфоцитов и эритроцитов (для реакции спонтанного розеткообразования с Т-лимфоцитами), инкубируют смесь при +37^oC 15 мин, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 1 минуты и, не встряхивая, помещают пробирки в холодильник при 4^oC на 18 ч.

Постановка реакции между тимоцитами и ксеногенными эритроцитами: в пробирке смешивают равные объемы (по 0,1 мл) суспензии тимоцитов, эритроцитов (для реакции с тимоцитами), и декомплементированной сыворотки морской свинки, инкубируют при комнатной температуре (+22^oC) в течение 30 мин, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 мин и оставляют в холодильнике при +4^oС на 18 ч.

Постановка реакции между спленоцитами и ксеногенными эритроцитами: в пробирке смешивают равные объемы (по 1 мл) суспензии спленоцитов, сенсибилизированных эритроцитов и недекомплементированной сыворотки морской свинки, инкубируют при комнатной температуре (+22^oC) в течение 30 мин, центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин, оставляют в холодильнике при +4^oC на 18 ч.

По окончании инкубации при +4^oС в течении 18 ч осадок в каждой пробирке ресуспендируют осторожным вращением пробирки между ладонями. Приготавливают мазок на предметном столе из капли суспензии, подсчитывают под микроскопом (окуляр х10, объектив х40) 100 лимфоцитов, определяя количество розеткообразующих клеток в принимая за розеткообразующие клетки лимфоцит с тремя и более присоединенными эритроцитами. Для лучшей визуализации результатов высушенный мазок фиксируют 10 каплями красителя-фиксатора Мая-Грюнвальда, через 3 мин прибавляют 10 капель нейтральной дистиллированной воды, через 1 мин смывают краситель водой и высушивают на воздухе. На мазок наливают свежеприготовленный раствор красителя Романовского-Гимза на 10 мин, смывают краску водой и высушивают. В окрашенных препаратах лимфоциты имеют фиолетовый, а эритроциты розовый цвет. Подсчитывают количество розеткообразующих клеток на 100 лимфоцитов.

Резкое увеличение количества розеткообразующих клеток по сравнению с контрольными (интактными) животными и с животными, которым предварительно был введен растворитель, в экспериментальной группе свидетельствует о наличии мембранотоксических свойств у тестируемого ксенобиотика.

Известно применение результатов реакции спонтанного розеткообразования лимфоцитов с ксеногенными эритроцитами для популяционной дифференцировки и препаративного выделения иммунокомпетентных клеток (2). Однако, учитывая механизм взаимодействия клеток в процессе образования спонтанных розеток, этот метод может быть применен для выявления мембранотоксичных ксенобиотиков. Образование спонтанных розеток не связано со специфической иммунной реакцией: адгезия не носит антигенспецифического характера, а обусловлена взаимодействием определенных поверхностных структур лимфоцитов с эритроцитами. Такими поверхностными структурами являются Е-рецепторы к эритроцитам на поверхности тимусзависимых клеток (Т-лимфоцитов периферической крови и тимоцитов), и рецепторы к третьему компоненту комплемента (СЗ) на мембранах спленоцитов.

Е-рецептор экспрессирован на 70% лимфоцитов крови, 100% Т-клеток, 80-100% тимоцитов и 20-30% спленоцитов. Е-маркер могут также нести гранулоциты и тромбоциты. Е-рецептор может иметь различные конформационные состояния, при которых некоторые эпитопы оказываются скрытыми, конформационные изменения при этом обусловлены изменением мембран лимфоцитов. Поэтому вещества, обуславливающие маскировку и демаскировку Е-рецепторов через изменение мембраны лимфоцита, вызывают резкое изменение количественных характеристик реакции спонтанного розеткообразования (количества Е-розеткообразующих клеток Е-РОК).

Рецепторы к СЗ-компоненту комплемента, выявляемые методом ЕАС-розеткообразования (с помощью эритроцитов, сенсибилизированных антителами и комплементом), экспрессированы на В-лимфоцитах периферической крови и лимфоидных органов, а в отдельных случаях на Т- или "нуль"-клетках.

Согласно современной классификации мембранотоксинов, т.е. веществ, обладающих тропностью к компонентам мембран и оказывающих на нее определенное воздействие, соединения, модифицирующие липидный, белковый или углеводный компоненты мембран, вызывают изменение адгезивных и рецепторных свойств биомембраны. Следовательно, мембранотоксичность химического вещества может быть оценена по вызванной им модификации компонентов биомембраны, проявляющейся в изменении межрецепторных и адгезивных взаимодействий. В таком случае воздействие мембранотоксина на биологическую мембрану клетки вызывает структурную модификацию ее, перераспределение молекул в белковом компоненте и липидном бислое мембран, маскировку или демаскировку различных эпитопов мембранных рецепторов.

Достаточная изученность рецепторного аппарата лимфоидных клеток позволяет использовать их в качестве тест-системы для оценки такой модификации. Согласно классификации критериев активации иммунокомпетентных клеток, к ранним признакам активации относятся прежде всего изменения клеточной мембраны, а к более поздним появление новых маркеров (рецепторов и антигенов). Собственно иммуномодулирующий, а не мембранотоксический эффект ксенобиотика в организме проявляется более чем через 24 ч от момента введения ксенобиотика в организм (в среднем, через 10-14 дней), т.к. рециклинг и восстановление поверхностных рецепторов лимфоцитов происходит в течение 24 ч от момента воздействия ксенобиотика. Изменения же рецепторного аппарата в период до 24 ч от момента воздействия выражаются в явлениях маскировки и демаскировки рецепторов, их конформационной перестройки, изменения их внутримембранной мобильности, следствием чего является перераспределение, эндоцитоз или гиперэкспрессия рецепторов, а также увеличение фракции клеток, вступающих в реакцию розеткообразования через модифицированные рецепторы (т.е. Е-РОК и ЕАС-РОК).

Исходя из вышеизложенного, ранние изменения количественных параметров реакции спонтанного розеткообразования, проявляющиеся до 24 ч от момента введения ксенобиотика, свидетельствуют о наличии модификации поверхностных структур лимфоидных клеток под воздействием вводимых в организм ксенобиотиков и могут служить доказательством мембранотоксичности последних.

Известны технические решения, в которых выявление мембранотоксичности химических веществ осуществляется с помощью радиоактивного мечения последних, внедрения в биомембраны флюорецентных зондов, определения активности мембраноассоциированных ферментов. Однако сложность проведения вышеперечисленных методов, предварительное выделение препаратов биомембран или клеток мишеней, искусственное моделирование взаимодействия ксенобиотика с биомембраной без учета метаболизма химического вещества в организме ограничивают возможность их применения в качестве скрининг-теста. Заявляемое же техническое решение, производимое в условиях in vivo, достаточно просто и доступно в качестве скрининг-теста на мембранотоксичные химические вещества.

Предлагаемое тестирование мембранотоксичных ксенобиотиков в реакции спонтанного розеткообразование осуществлено следующим образом: выделялись 6 групп экспериментальных и 4 группы контрольных животных (крыс):

1. Контрольная 1 интактные крысы 5 животных

2. Контрольная 2 за 24 ч до забоя животным вводился растворитель акрилатов (бутилакрилата и метилакрилата), тестируемых на мембранотоксичные свойства) подсолнечное масло, не обладающие мембранотоксическим эффектом, по 0,5 мл внутрибрюшинно, 5 животных.

3. Контрольная 3 животным за 24 ч до забоя внутрибрюшинно вводилось вещество с заведомо известными мембранотоксическими свойствами новокаин, вызывающий нарушение структуры липидного биослоя биомембран в высоких концентрациях, в дозе 1/4 ЛД₅₀, что составляет 6,4 мг/мл массы животного 5 животных.

4. Контрольная 4 животным за 24 ч до забоя внутрибрюшинно вводилось вещество с заведомо известными мембранотоксическими свойствами, принадлежащее к химической группе тестируемых веществ акриламид, в дозе 1/4 ЛД₅₀, что составляет 35 мг/мл массы животного 5 животных.

5. Экспериментальная 1 животным за 24 ч до забоя внутрибрюшинно вводился тестируемый на мембранотоксичные свойства ксенобиотик бутилакрилат (БА) в дозе 1/4 ЛД₅₀, что составляет 0,06 г в 0,5 мл подсолнечного масла.

6. Экспериментальная 2 животным за 24 ч до забоя внутрибрюшинно вводился БА в дозе 1/2 ЛД₅₀, что составляет 0,12 г в 0,5 мл подсолнечного масла, 5 животных.

7. Экспериментальная 3 животным за 24 ч до забоя, внутрибрюшинно вводился тестируемый на мембарнотоксичные свойства ксенобиотик - метилметакрилат (ММА) в дозе 1/4 ЛД₅₀, что составляет 0,13 г в 0,5 мл подсолнечного масла 5 животных.

8. Экспериментальная 4 животным за 24 ч до забоя внутрибрюшинно вводился метилметакрилат в дозе 1/2 ЛД₅₀, что составляет 0,26 г в 0,5 мл подсолнечного масла 5 животныx.

9. Экспериментальная 5 животным за 24 ч до забоя, внутрибрюшинно, в разных шприцах, вводились тестируемые ксенобиотики БА и ММА в дозе по 1/4 ЛД₅₀, что составляет 0,06 и 0,13 г в 0,5 мл подсолнечного масла соответственно 5 животных.

10. Экспериментальная 6 животным за 24 ч до забоя, внутрибрюшинно, в разных шприцах, вводились БА и ММА в дозе по 1/2 ЛД₅₀, что составляет 0,12 и 0,26 г в 0,5 мл подсолнечного масла соответственно 5 животных.

Через 24 ч от момента введения веществ животные забивались методом декапитации. Исследуемую кровь собирали в пробирки, содержащие свободный от консерванта гепарин (100 ЕД/мл). Гепаринизированную кровь разводили в соотношении 1:2 средой 199, осторожно наслаивали пастеровской пипеткой на разделяющий раствор фиколла-верографина (плотность 1,077) в соотношении 2:1 в центрифужной пробирке, удерживаемой под углом 45^o и сразу же центрифугировали при 1500 об/мин в течение 25 мин. Пастеровской пипеткой снимали плазму вместе с диффузным мутноватым слоем тромбоцитов, а затем отсасывали мононуклеарные клетки, образующие беловатый слой над разделяющим раствором. Последние переносили в центрифужные пробирки и отмывали в десятикратном объеме среды 199, центрифугируя при 1500 об/мин 10 минут дважды. Осадок ресуспендировали в 1 мл среды 199, подсчитывали количество жизнеспособных клеток в суспензии до 3х10³/мл среды.

Для выделения лимфоцитов из тимуса и селезенки животных эти органы выделяли сразу после забоя животных путем проведения срединной стернотомии и срединной лапаротомии. Тимус и селезенку помещали в разные пробирки в питательную среду 199 в объеме 2 мл, ткань тимуса и селезенки тщательно ресуспендировали ножницами, а затем пастеровской пипеткой. Прогомогенизированную таким образом ткань фильтровали через один слой капроновой сетки, дважды отмывали средой 199 в десятикратном объеме при 1500 об/мин в течение 10 мин. Осевшие клетки ресуспендировали в объеме 1 мл среды 199, подсчитывали количество жизнеспособных клеток в камере Горяева при окраске трипановым синим и доводили количество клеток в суспензии до 5х10⁶/мл среды для тимоцитов и 3х10⁶/мл среды для спленоцитов.

Для приготовления суспензии эритроцитов, вступающих в реакцию спонтанного розеткообразования с Т-лимфоцитами периферической крови и тимоцитами, дефибринированную кровь морской свинки (2 мл) трижды отмывают средой 199, центрифугируя при 1500 об/мин в течение 5 мин. Из отмытых эритроцитов приготавливали 0,5%-ную суспензию в среде 199. Для приготовления суспензии эритроцитов, вступающих в реакцию спонтанного розеткообразования со спленоцитами, дефибринированную кровь морской свинки (2 мл) трижды отмывали средой 199, центрифугируя при 1500 об/мин в течение 5 мин, из отмытых эритроцитов приготавливали 50%-ную взвесь в среде 199. Гемолитическую сыворотку разводили по титру раствором хлорида натрия (0,15 моль/л). Смешивали в пробирке равные объемы 50%-ной суспензии эритроцитов и гемолитической сыворотки, разведенной по титру. Инкубировали смесь в термостате при +37^oC в течение 30 мин для сенсибилизации эритроцитов. После сенсибилизации эритроциты дважды отмывали средой 199 в десятикратном объеме среды, центрифугируя при 1000 об/мин 5 мин. Осадок ресуспендировали в среде 199 для получения 5%-й взвеси.

Для получения недекомплементированной сыворотки морской свинки отделение сыворотки от сгустка крови производили центрифугированием в течение 15 мин при 3000 об/мин. Пастеровской пипеткой сыворотку отсасывали и приготовляли ее 1%-ный раствор в среде 199.

Для получения декомплементированной сыворотки морской свинки отделенную от сгустка крови сыворотку (путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 15 мин) помещали в термостат при +56^oC на 1 ч. Перед употреблением сыворотку разводили средой 199 1:5.

К 5%-ной взвеси сенсибилизированных эритроцитов, вступающих в реакцию со спленоцитами, добавляли равный объем недекомплементированной сыворотки морской свинки, разведенной 1:10. Инкубировали смесь при +37^oC в течение 30 мин, затем дважды отмывали эритроциты и приготавливали из них 0,5% взвесь в среде 199, разводя 1:10.

Постановка реакции Т-лимфоцитов периферической крови и ксеногенных эритроцитов осуществлялась следующим образом: в пробирке смешивали равные объемы (по 0,5 мл) суспензии лимфоцитов и эритроцитов (для реакции спонтанного розеткообразования с Т-лимфоцитами), инкубировали смесь при +37^oС 15 мин, центрифугировали при 1000 об/мин в течение 1 мин и, не встряхивая, помещали пробирки в холодильник при +4^oС на 18 ч.

Постановка реакции между тимоцитами и ксеногенными эритроцитами: в пробирке смешивали равные объемы (по 0,1 мл) суспензии тимоцитов, эритроцитов (для реакции с тимоцитами) и декомплементированной сыворотки, инкубировали при комнатной температуре (+22^oC) в течение 30 мин, центрифугировали при 1500 об/мин в течении 5 мин и оставляли в холодильнике при +4^oC на 18 ч. Постановка реакции между спленоцитами и ксеногенными эритроцитами: в пробирке смешивали равные объемы (по 0,1 мл) суспензии спленоцитов, сенсибилизированных эритроцитов и недекомплементированной сыворотки морской свинки, инкубировали при комнатной температуре (+22^oC) в течение 30 мин, центрифугировали 5 мин при 15000 об/мин, оставляли в холодильнике при +4^oC на 18 ч.

По окончании инкубации ресуспендировали осадки осторожным вращением пробирки ладонями. Приготавливали мазок на предметном стекле, фиксировали 10 каплями красителя-фиксатора Мая-Грюнвальда, через 3 мин прибавляли 10 капель нейтральной дистиллированной воды, через минуту смывали краситель водой и высушивали на воздухе. На мазок накапливали свежеприготовленный раствор красителя Романовского-Гимза на 10 мин, смывали краску водой и высушивали. В окрашенных препаратах подсчитывали под микроскопом (окуляр х10, объектив х40) 100 лимфоцитов, определяя количество розеткообразующих клеток в принимая за розеткообразующие клетки лимфоцит с тремя и более присоединенными эритроцитами.

Полученные данные были обработаны методами математической статистики с использованием Т-критерия Стъюдента. В результате проведенных исследований получены следующие результаты:

1. Относительное (%) количество Е-розеткообразующих клеток в периферической крови: контроль 1 54,0 4,8, контроль 2 67,0 2,0, контроль 3 81,2 1,9, Р < 0,01, контроль 4 81,0 0,69, Р < 0,01, эксперимент 1 76,6 3,0, Р < 0,05, эксперимент 2 63,8 1,6, эксперимент 3 71,4 3,1, P < 0,05, эксперимент 4 84,5 1,1, Р < 0,01, эксперимент 5 62,8 2,7, эксперимент 6 90,8 1,95, Р < 0,001.

2. Относительное (%) количество Е-розеткообразующих клеток из числа тимоцитов: контроль 1 51,2 4,2, контроль 2 53,1 4,8, контроль 3 80,8 2,4, Р < 0,01, контроль 4 84,6 1,9, Р < 0,001, эксперимент 1 83,4 1,7, Р < 0,001, эксперимент 2 68,5 4,3, Р < 0,05. эксперимент 3 79,6 1,9, Р < 0,001, эксперимент 4 80,5 1,1, Р < 0,01, эксперимент 5 68,8 2,9, Р < 0,05. эксперимент 6 83,0 2,2 Р < 0,01.

3. Относительное (% ) количество ЕАС-розеткообразующих клеток из числа спленоцитов: контроль 1 43,6 1,15, контроль 2 44,5 1,9, контроль 3 72,6 2,0, Р < 0,001, контроль 4 77,6 1,6, Р < 0,001, эксперимент 1 76,4 2,5, Р < 0,001, эксперимент 2 59,8 4,6, Р < 0,05, эксперимент 3 77,4 2,3, Р < 0,001 эксперимент 4 85,0 1,3, Р < 0,001, эксперимент 5 69,0 3,4 Р < 0,001, эксперимент 6 71,0 1,8, P < 0,001.

Резкое увеличение через 24 ч до момента введения ксенобиотика количества розеткообразующих клеток по сравнению с интактными животными и животными, которым вводился немембранотоксичный растворитель, свидетельствует о наличии мембранотоксических свойств у тестируемых ксенобиотиков бутилакрилата и метилметакрилата в исследуемых дозах.

Эксперимент проведен на 50 крысах.

Итак, получение результата осуществлено на деле. Предложенное техническое решение достаточно просто и доступно в качестве скрининг-теста на мембранотоксичные химические вещества.