способ идентификации форм гомоцистинурии

Формула изобретения

Способ идентификации форм гомоцистинурии, включающий исследование активности бета-цистатионинсинтазы в биоптате печени, постановку диагноза заболевания с последующим определением чувствительности к пиридоксальфосфату, отличающийся тем, что способ осуществляется in vitro при этом инкубацию супернатанта гомогената биоптата проводят в присутствии 2-меркаптоэтанола, L-цистеина и ацетата свинца при соблюдении требований стехиометрии протекающих реакций, затем измеряют оптическую плотность инкубационной среды в области 360 нм, выявляют поглощение в этой области в отсутствии и присутствии пиридоксальфосфата и при увеличении его в присутствии пиридоксальфосфата идентифицируют В₆-зависимую форму, а при его неизменности - В₆-резистентную форму гомоцистинурии.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к диагностике наследственных метаболических заболеваний у детей нарушениям обмена серотонинсодержащих аминокислот метионина и гомоцистеина. Фермент -цистатионинсинтаза играет важную роль в метаболизме гомоцистеина в организме животных и человека. Его отсутствие в результате генной мутации приводит к заболеванию гомоцистинурией и вызывает глубокие нарушения жизненно важных органов и систем: опорно-двигательного аппарата, глаз, сердечно-сосудистой и центральной нервной систем. Изобретение может быть использовано для диагностики и идентификации форм гомоцистинурии у детей.

Описанные в литературе способы определения фермента цистатионинсинтазы основаны на использовании метода хроматографического разделения продуктов реакции с последующим определением цистотионина колориметрическим методом или с использованием радиоактивно меченного цистеина. Эти методы отличаются трудоемкостью, продолжительны по времени и требуют специально оборудованных мест для работы (I.Clin Invest, 1978, 61, 645-653; Amm. InFern.Med. 1969, 71, 209-211; I.Clin. Invest 1972, 51, 1034-1037).

В качестве ближайшего аналога предлагается рассматривать работу Mudd и др. (1965). Суть способа аналога заключается в следующем: 400 мкл гомогената печени человека (либо крысы, кролика, коровы, лошади), содержащих 0,1 0,5 мг белка, 60 мкмоль трис-НСl рН 8,3, 1 мкмоль ЭДТА, 0,015 ммоль пиридоксальфосфата, 0,07 мкмоль L-цистатионина, 5 мкмоль L-гомоцистеина, 1 мкмоль (10^-5 имп/мин) L-серина, инкубируют в течение 135 мин, затем осаждают белки ТХУ, помещают прозрачный супернатант на колонку с Дауэксом, элюируют аминокислоты и определяют радиоактивность. Величина активности цистатионинсинтазы в норме 150 500 мкмоль/мг, у больных 3 6 мкмоль/мг белка за 135 мин.

В качестве технического результата предложения предлагается рассматривать ускорение и упрощение способа при сохранении высокой чувствительности, точности и адекватности способа.

Технический результат достигается следующим образом.

К 10 20 мг свежевзятого биоптата печеночной ткани добавляют 0,6 1,0 мл охлажденного ТРИС-НСl буфера рН 8,5 8,8, содержащего 0,1 М 2-меркаптоэтанола, растирают в стеклянном гомогенизаторе в течение 1 мин при температуре 4^oС. Полученный гомогенат осторожно сливают в пластмассовую центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 10 12 тыс. g в течение 10 мин. Прозрачную слегка опалесцирующую жидкость осторожно отбирают пипеткой и используют для определения активности фермента.

Активность цистатионинсинтазы определяют по начальной скорости образования коллоидного раствора сульфида свинца (PbS), регистрируя прирост оптической плотности при 360 нм (шкала 0,2) за 5 мин в термостатированной кювете спектрофотометра при t 38^oС.

Инкубационная смесь содержит: 200250 мкл надосадочной жидкости, содержащей фермент цистатионинсинтазу, 30 мкл 0,2 М раствора L-цистеина и 20 мкл 0,003 М раствора ацетата свинца (PbAc₂) и буфер Трис-НСl рН 8,8 - 8,5 до общего объема 300 мкл.

Активность цистатионинсинтазы выражают в нмолях сероводорода (H₂S), образованного в реакции b-замещения SH-группы цистеина, за мин при t 38^oС согласно следующей реакции:



Величину активности цистатионинсинтазы рассчитывают в нмолях, исходя из того, что поглощение А₃₆₀ 1,0 соответствует наличию 0,36 мкмоль сульфида в пробе. Активность выражают в нмолях сероводорода, образованного 1 мг ткани печени в мин. Для стандартизации условий инкубации каждый раз наряду с определением активности фермента в биоптатах печени больного гомоцистинурией определяли активность цистатионинсинтазы в печени крысы и биоптатах печени детей с недифференцированной олигофренией и мукополисахаридозами.

Для уточнения формы гомоцистинурии (B₆-резистентная и В₆-зависимая) инкубацию фермента с субстратами проводили в присутствии 5 мкг пиридоксальфосфата. Отсутствие изменений показателей активности цистатионинсинтазы объективно доказывает наличие у больного ребенка B₆-резистентной формы гомоцистинурии.

Данные по определению активности фермента у обследованных больных с гомоцистинурией представлены в таблице.

Как видно из таблицы, обнаружено резкое снижение показателей ферментативной активности у всех обследованных детей. Непосредственное воздействие пиридоксальфосфата на исследуемый фермент выявило полное отсутствие стимулирующего эффекта кофактора на активность цистатионинсинтазы у 8 больных, что позволило объективно доказать наличие B₆-резистентной формы гомоцистинурии у этих детей. У одного пробанда присутствие кофактора стимулировало активность цистатионинсинтазы в биоптате печени до 55 65% от нормы (подтверждена B₆-зависимая форма гомоцистинурии).

Клинические примеры.

Пример 1. Лена Ш. 12 лет, поступила в клинику с диагнозом болезнь Марфана. Девочка от 12 беременности, вторых родов. От первой беременности - здоровая 24-летняя дочь. Последующие 10 беременностей завершались медицинскими абортами. Настоящая беременность и роды протекали благоприятно. Девочка родилась с массой тела 3200 г и длиной 50 см. Закричала сразу. Раннее психомоторное развитие протекало с некоторой задержкой: голову держит с 3-х месяцев, сидит с 7, ходит с 1 года 3мес. говорит отдельные слова с полутора лет.

В анамнезе ребенка сведения о трех костных переломах: 2 перелома правого бедра в возрасте 1,5 и 3-х лет и перелом плеча в 6 лет, при этом нарушение целостности костной ткани возникали у больной при незначительной травме.

Родители считали ребенка больным с 4-летнего возраста, когда впервые обратили внимание на ее интеллектуальное недоразвитие. В 5 лет заметили снижение зрения. Окулисты диагностировали миопию высокой степени (выписаны очки -18 D). Лечение в краевой больнице по месту жительства не принесло должного эффекта, заболевание продолжало прогрессировать и при повторном осмотре через 6 мес. (в 5,5 лет) врачами был обнаружен уже подвывих хрусталиков, осложненный вторичной глаукомой. Состояние больной вызывало опасение у медиков и родителей, и ребенок был направлен в Институт глазных болезней им. Гельмгольца. В офтальмологической клинике у девочки впервые диагностирована болезнь Марфана и произведено удаление хрусталиков. С этого времени больная постоянно наблюдалась окулистами г. Москвы. Несмотря на экстирпацию хрусталиков глаукома неуклонно прогрессировала, и до поступления в нашу клинику больная была прооперирована еще дважды с негативными результатами. Для решения вопроса о целесообразности третьей операции и предоперационной подготовки ребенок направлен в отдел врожденных и наследственных заболеваний Института педиатрии МЗ РФ.

При поступлении обращали на себя внимание астеническое телосложение, длинные тонкие конечности, арахнодактилия кистей и стоп, воронкообразная деформация грудной клетки 1 степени, сколиоз, короткая шея, прогения. Волосы светло-русые. Глаза голубые. Физическое развитие ребенка несколько выше среднего, дисгармоничное: рост превышал возрастную норму на 1,5 стандартных отклонения, в то время как масса тела и окружность грудной клетки соответствовали средним значениям.

Со стороны внутренних органов не выявлено патологических изменений. Окулист подтвердил наличие афакии, вторичной глаукомы. Интеллект резко снижен, обучалась в специализированной школе-интернате для слабовидящих детей по вспомогательной программе и с большим трудом справлялась с заданиями. Заключение психолога свидетельствовало о полной непригодности больной к обучению.

Рентгенография длинных трубчатых костей констатировала умеренно выраженный диффузный остеопороз.

Учитывая поражение опорно-двигательного аппарата, глаз, ЦНС, необходимо было в первую очередь провести дифференциальный диагноз между болезнью Марфана и гомоцистинурией. Нарушения опорно-двигательной системы у больной идентичны изменениям скелета при болезни Марфана. Однако меньшая, чем при болезни Марфана, диссоциация весо-ростовых параметров, умеренно выраженный свод стопы, наличие остеопороза и неоднократные переломы в анамнезе более характерны для гомоцистинурии. Подвывих хрусталиков типичный симптом болезни Марфана и гомоцистинурии. Однако вторичная глаукома тяжелое осложнение, чаще свойственное гомоцистинурии. Наконец, грубое интеллектуальное недоразвитие ставило диагноз болезни Марфана под сомнение.

Таким образом, принимая во внимание клиническую симптоматику, наши исследования были направлены на изучение аминокислотного и минерального обменов, метаболизма соединительной ткани, сердечно-сосудистой и центральной нервной системы, органа зрения. Оценка состояния ряда органов и систем проводилась комплексно на основании совокупности данных клинических и параклинических методов исследования. Так, например, заключение об интактности сердечно-сосудистой системы у больной получено после клинических осмотров и данных рентгенографии, ЭКГ, ФКГ и ЭХО-кардиографии. Анализ этих результатов также свидетельствовал против диагноза болезни Марфана.

Исследования метаболитов соединительной ткани выявили повышение в 1,5 раза показателей почечной экскреции оксипролина и в 2 раза - гликозаминогликанов. Данные минерального обмена не изменены. Целенаправленное изучение аминокислотного спектра включало 2 этапа: качественную реакцию на гомоцистин (выявлена резко положительная проба) и хроматографию на ионообменных смолах. Диагностика второго этапа обнаружила гиперметионинемию (525 мкмоль на 1 л при норме 16 37 мкмоль на 1 литр) и гомоцистинемию (40 мкмоль на 1 литр, в норме отсутствует). Выведение с мочой этих веществ также было высоким и составляло 172 мкмоль за 24 часа (при норме для метионина 20 - 95 мкмоль за 24 часа) и 77 мкмоль за 24 часа (гомоцистин в норме отсутствует).

Определение активности фермента -цистатионинсинтазы в биоптате печени девочки выявило резкое ее снижение (до 0,012 нмоль на мг ткани печени в 1 мин (см. N 9 в табл.) и полное отсутствие стимулирующего эффекта кофактора пиридоксаль-5^"-фосфата на исследуемый фермент.

Таким образом, крайне низкий показатель ферментативной активности b-цистатионинсинтазы и данные аминокислотного спектра сыворотки крови и мочи послужили объективным доказательством наличия у ребенка B₆-резистивной формы гомоцистинурии.

Патогенетическое лечение, включающее диетическую коррекцию, антикоагулянты, дегидратационные препараты и вещества, стимулирующие деятельность ЦНС, дало положительные результаты: нормализовался уровень метионина в сыворотке крови и показатели его почечной экскреции, исчез гомоцистин, уменьшилось внутриглазное давление, улучшился эмоциональный тонус больной.

Пример 2. Оля К; 11 лет, поступила в клинику с жалобами на снижение зрения, особенности телосложения, трудности усвоения школьной программы.

Девочка от 1-ой нормально протекавшей беременности, физиологических родов. Родилась с массой тела 3,000 кг и длиной 50 см. Закричала сразу. На грудном вскармливании. Отмечалась небольшая задержка раннего психомоторного развития: голову держит с 3-х месяцев, сидит с 8, ходит с 1 года 3 мес. говорит с 3-х лет. Родители считают ребенка больным с 6-летнего возраста, когда впервые обратили внимание на снижение зрения и высокий рост девочки. Окулисты диагностировали у ребенка двусторонний подвывих хрусталиков, и больная была направлена в клинику генетики с диагнозом болезни Марфана.

При поступлении обращали на себя внимание следующие особенности: астеническое телосложение, высокий рост (выше 97 центили), арахнодактилия кистей и стоп, сколиоз 1 ст. Со стороны внутренних органов патологии не обнаружено. Окулист подтвердил эктопию хрусталиков. IQ 75 ед. (при норме 85 115 ед.).

Данные анамнеза, генеалогии, совокупность фенотипических признаков и показатели рентгено-функциональных методов исследования позволили исключить у ребенка синдром Марфана и заподозрить гомоцистинурию. Анализ аминокислотного спектра сыворотки крови и мочи, выполненный методом хроматографии на ионообменных смолах, обнаружил гиперметионинемию (432 мкмоль на 1 л при норме 16 37 мкмоль на 1 литр) и гомоцистинемию (30 мкмоль на 1 литр, при норме 0). Экскреция с мочой этих метаболитов также была высокой и составляла 250 мкмоль за 24 часа (при норме для метионина 20 95 мкмоль за 24 часа) и 192 мкмоль за 24 часа (гомоцистин в норме отсутствует). Определение активности фермента b-цистатионинсинтазы в биоптате печени пробанда выявило ее снижение до 0,158 нмоль на 1 мг ткани печени за 1 мин (см. N 5 в табл.). Попытка ститулировать активность фермента пиридоксаль-5^"-фосфатом оказалась мало эффективной. Таким образом, на основании объективных данных ребенку был поставлен окончательный диагноз B₆-резистентная форма гомоцистинурии и назначено патогенетическое лечение.

Пример 3. Ира В. 5 лет, поступила в клинику с жалобами на плохое зрение и снижение интеллекта. Девочка от первой нормально протекавшей беременностей и родов. Родилась с массой тела 3,200 кг и длиной 50 см. Закричала сразу. На грудном вскармливании. Раннее психомоторное развитие протекало с некоторой задержкой: голову стала держать с 3,5 мес. сидеть с 9, ходить с 1,5 лет, говорить с 3,5 лет. Родители считают ребенка больным с 1 года, когда впервые обратили внимание на задержку психомоторного развития. В 4,5 года заметили снижение зрения. Окулист диагностировал подвывих хрусталиков, и ребенок был направлен в клинику врожденных и наследственных заболеваний НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ с предполагаемым диагнозом болезнь Марфана.

При поступлении обращали на себя внимание следующие фенотипические особенности пробанда: астеническое телосложение, высокий рост (выше 97 центили), арахнодактилия кистей и стоп, короткая шея, "крыловидные" лопатки, вальгусная деформация коленных суставов. Волосы светло-русые, мягкие, вьющиеся крупными завитками, глаза голубые.

Со стороны внутренних органов патологии не обнаружено. Окулист подтвердил эктопию хрусталиков и обнаружил наличие вторичной глаукомы. IQ 60 ед. (при норме 85 115 ед.). Данные генеалогии, анамнеза, совокупность фенотипических признаков и результаты рентгено-функциональных методов исследования (отсутствие признаков аналогичного заболевания у родителей и ближайших родственников пробанда, нормальные показатели ЭКГ, ФКН и ЭХО-кардиографии, незначительный остеопороз длинных трубчатых костей, задержка психомоторного развития, начинающаяся вторичная глаукома) позволили снять диагноз болезни Марфана и заподозрить гомоцистинурию.

Аминокислотный спектр сыворотки крови и мочи (хроматография на ионообменных смолах) показал высокий уровень метионина (172 мкмоль на 1 литр при норме 16 37 мкмоль на 1 литр) и гомоцистина (325 мкмоль за 24 часа при норме 0), а также высокую экскрецию этих метаболитов с мочой (432 и 535 мкмоль за 24 часа соответственно). Величина активности фермента b-цистатионинсинтазы в биоптате печени пробанда была снижена и составляла 0,022 нмоль на 1 мг ткани печени за 1 мин (см. N 1 в табл.). Ституляция активности фермента непосредственным воздействием 5 мкг пиродоксаль-5^"-фосфата восстанавливала активность до 57% от нормы. Таким образом, крайне низкий показатель активности фермента b-цистатионинсинтазы в отсутствие пиридоксальфосфата и восстановление активности до 57% от нормы в присутствии кофактора позволили окончательно подтвердить наличие у ребенка B₆-зависимой формы гомоцистинурии.

Терапия относительно высокими дозами витамина B₆ (100 мг в сутки) позволила добиться полной биохимической ремиссии (нормализовался уровень метионина, повысилась концентрация цистина, исчез гомоцистин в сыворотке крови и моче) и существенно уменьшить тяжесть клинической симптоматики заболевания (нормализовалось внутриглазное давление, улучшился эмоциональный тонус больной, несколько повысился IQ до 65 ед.).