синтезатор олиго/поли/нуклеотидов

Формула изобретения

Синтезатор олиго(поли)нуклеотидов, содержащий реактор проточного типа, в рабочем объеме которого размещен твердофазный носитель, связанный с нуклеозидным компонентом, блок смешивания реагентов, блоки размещения и подачи реагентов и промывочной жидкости, включающие сосуды для подачи реактивов и системы продавливания реактивов газом, каналы для подачи реагентов, промывающей жидкости и вывода отработанных реактивов, запорные клапаны на каналах, блок управления, отличающийся тем, что дополнительно содержит блок нагрева и поддержания заданной температуры реактивов, дозатор, вход которого соединен с выходом реактора, а выход с каналом вывода отработанных реактивов, и гидростатические затворы, причем вход каждого гидростатического затвора соединен с каналом подачи соответствующего реагента, а также с каналом подачи промывающей жидкости, выход каждого гидростатического затвора соединен с входом блока смешивания реагентов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биоорганической химии и может быть использовано в молекулярной биологии, генной инженерии и медицине.

Известен синтезатор полинуклеотидов (1), содержащий реактор проточного типа, внутри которого размещен твердофазный носитель, блоки размещения и подачи основных и вспомогательных реагентов, блок смешивания мономера и активирующего агента, который выполнен в виде последовательно соединенных емкости, клапана и канала.

Недостатком известного устройства является малая производительность и большой расход дорогостоящих реагентов из-за снижения эффективности смеси реагентов в результате относительно длительного нахождения ее в смешанном состоянии до подачи в реактор.

Задачей изобретения является повышение производительности синтезатора и уменьшение расхода наиболее дорогостоящих реактивов.

Такой результат достигается тем, что синтезатор олиго(поли)нуклеотидов, содержащий реактор проточного типа, в рабочем объеме которого размещен твердофазный носитель, связанный с нуклеовидным компонентом, смеситель для быстрого смешивания реагентов, содержащий камеру на входе и пористую перегородку, размещенную на входе реактора, блоки размещения и подачи реагентов и промывающей жидкости, включающие сосуды для реактивов и системы продавливания реактивов газом, каналы для подачи реагентов, промывающей жидкости и вывода отработанных реактивов, запорные клапаны на каналах, блок нагрева и поддержания заданной температуры реактивов, блок управления, согласно изобретению дополнительно содержит микродозатор, вход которого соединен с выходом реактора, а выход с каналом вывода отработанных реактивов, и гидростатические клапаны, причем вход каждого гидростатического клапана соединен с каналом подачи соответствующего реагента, а также каналом через запорный клапан с блоком размещения и подачи промывающей жидкости, выход каждого гидростатического клапана соединен с входом смесителя.

Сопоставительный анализ с известными устройствами показывает, что предложенное решение содержит существенные отличия, которые не следуют явным образом из уровня техники и соответствуют критерию изобретения "новизна". Введение новых элементов и соединений позволило устранить недостатки известного решения, которые были выявлены в процессе эксплуатации синтезатора в режиме быстрого смешивания реагентов. Так как в реактор в каждом цикле подаются малые порции реагентов, даже небольшое количество "грязи" остатков несовместимых друг с другом реагентов в плохо промываемых местах подводящих каналов, приводит к перерасходу дорогостоящих реактивов и увеличению времени синтеза. К такому же результату приводит и отклонение от оптимального режима подачи реагентов и смеси реагентов в реактор. Это связано с тем, что известное устройство задает режим подачи реагентов и смеси реагентов в реактор по времени открытия клапана канала подачи и выпускного клапана на выходе реактора. Однако, как оказалось, это время не пропорционально объему пропускаемой смеси прореагировавших реагентов через реактор и зависит от давления рабочего газа, вязкости реактива и других причин, что приводит к увеличению как объемов подаваемых реагентов, так и времени выдержки в реакторе. Этот недостаток устранен в предложенном решении путем введения в синтезатор микродозатора. Он может иметь различную конструкцию (3), обеспечивающую заданную точность и скорость выполнения операции дозирования. Однако при этом существенным является место расположения микродозатора в синтезаторе. Микродозатор, размещенный перед реактором, нуждается в регулярной промывки при смене реагентов, что увеличивает расход промывочных реактивов и времени синтеза. Как показали исследования, оптимальным является размещение микродозатора на выходе реактора, что снимает необходимость заботится о его чистоте и позволяет использовать любую конструкцию с нужными характеристиками. Воспрепятствовать попаданию одних реагентов в каналы подачи других, что не позволило полностью удалить их остатки при промывке, удалось с помощью гидростатических клапанов, отсекающих каналы подачи реагентов друг от друга со стороны камеры смесителя. Гидростатические клапаны представляют собой изогнутые П-образные трубки, вертикальные участки которых имеют перепад высоты, определяющий пороговое давление P_п. Их выбирают такими, чтобы P₁<P<P, где P₁ давление жидкости в камере смесителя, возникающее из-за гидросопротивления участка пористая перегородка - реактор, а P₂ давление жидкости, задаваемое системой продавливания реактивов газом. Промывка через гидростатические клапаны всех участков каналов, подходящих к смесителю, полностью исключает возможность загрязнения реагентов остатками реактивов.

Изобретение поясняется блок-схемой синтезатора.

Синтезатор содержит блок 1 размещения и подачи реагентов, включающий сосуды для реагентов и систему продавливания реагентов газом, блок 2 размещения и подачи промывающей жидкости, каналы 3 подачи реактивов и их вывода из реактора, запорные клапаны 4, гидростатические клапаны 5, смеситель 6, содержащий камеру 7 и пористую перегородку 8, проточный реактор 9 с размещенным в нем носителем, микродозатор 10, блок 11 управления, блок 12 нагрева и поддержания заданной температуры реактивов. Каждый сосуд для реактивов блока 1 размещения и подачи реагентов соединен каналом 3 через запорный клапан 4 с входом соответствующего гидростатического клапана 5, выход блока 2 размещения и подачи промывающей жидкости также соединен каналами 3 через запорные клапаны 4 с входом каждого гидростатического клапана 5 и с камерой 7 смесителя 6, с которой соединены и все выходы гидростатических клапанов 5. Пористая перегородка 8 смесителя 6 размещена на входе реактора 9, его выход соединен каналом 3 с входом микродозатора 10.

Синтезатор используют следующим образом. Перед началом синтеза в блоках 1 и 2 подготавливают сосуды с реактивами, задают в них рабочее давление газа. Затем проводят промывку всех каналов, смесителя и рабочего объема реактора. Для этого сигналом с блока 11 управления открывают запорные клапаны 4, обеспечивающие подачу абсолютного растворителя из блока 2 размещения и подачи промывающей жидкости. После этого, открывая запорные клапаны 4 соответствующих каналов 3 по программе проведения синтеза нуклеотида заданной структуры, подают в смеситель 6 нужные реагенты, которые, смешиваясь в камере 7 и пористой перегородке 8, поступают в рабочий объем реактора 9. Заданное время контакта смеси реагентов с твердофазным носителем определяет момент включения микродозатора 10, который задает как объем подаваемой смеси, так и скорость подачи ее в реактор. Гидростатические клапаны 5 препятствуют попаданию реагентов, участвующих в данном этапе синтеза, в подводящие каналы 4 других реагентов. Отработав заданное количество циклов на одной смеси, синтезатор переводят на режим промывки. Все гидростатические клапаны 5, смеситель и реактор промываются абсолютным растворителем путем подачи его из блока 2 по сигналам из блока 11 управления на соответствующие клапаны 4 и микродозатор 10. Аналогичным образом, подавая заданное сочетание реагентов в смеситель, а затем в реактор, проводят синтез следующих звеньев нуклеотида. Промывкой по окончании синтеза очередного звена нуклеотида всех узлов синтезатора, где могли задержаться остатки реагентов, исключается возможность загрязнения очередной партии и гарантируется стабильность качества конечного продукта.

П р и м е р. Синтезатор олиго(поли)нуклеотидов был выполнен в соответствии с блок-схемой, представленной на чертеже. Реактор проточного типа был выполнен с подачей реагентов снизу. В качестве твердофазного носителя использовали СРG-350 фирмы Serva с емкостью нуклеозида 10 мкмоль/г. Пористая перегородка на входе реактора была выполнена из частиц фторопласта, размещенных между двумя сетками. Синтезатор был рассчитан на использование шести видов реагентов и имел в блоке размещения и подачи реагентов соответственно 6 сосудов и 6 каналов с запорными клапанами, по которым реагенты подавали через гидростатические клапаны в смеситель. Гидростатические клапаны были выполнены из стеклянных трубок с внутренним диаметром 0,5 мм и высотой запорного колена 3 мм. Выходы всех гидроклапанов были соединены с камерой смесителя, а к входам подключены через запорные клапаны каналы от сосуда с промывающее жидкостью абсолютным ацетонитрилом. В качестве микродозатора использовали поршневой шприц-насос с приводом от шагового двигателя ДШИ-200-2-1, который обеспечивал дозирование объема реагентов с точностью 1 мкл при объемной скорости вывода смеси из реактора в режимах 12, 5, 25, 50, 100 мкл/с. При использовании известного синтезатора (2) точность дозировки не превышала 10 мкл, а объемная скорость вывода смеси из реактора зависела от давления газа в системе подачи и менялась в процессе проведения синтеза. Режим проведения синтеза определялся последовательностью включения - выключения определенных запорных клапанов и шагового двигателя микродозатора и задавался программой управляющей ЭВМ. Подачу реагентов, растворов мономера и конденсирующего агента в смеситель проводили импульсами длительностью 0,1 с, повторяя эту процедуру 3 раза с паузами в 1 с. После синтеза каждого звена нуклеотида все гидроклапаны и каналы, соединяющие их с камерой смесителя, промывали в течение 0,2 с абсолютным ацетонитрилом. Расход промывочной жидкости при этом составлял 12 мкл. При синтезе поддерживали температуру 501^oC. Окисление проводили в течение 5 мин смесью раствора йода в ледяной уксусной кислоте и пиридина, а затем промывали пиридином. Снятие нуклеотида с твердого носителя проводили 25%-ным водным раствором аммиака, из которого затем с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой выделяли синтезированный полинуклеотид.

Предлагаемый синтезатор благодаря введению микродозатора и эффективной системе защиты каналов от загрязнения другими реагентами позволил уменьшить расход дорогостоящих реагентов по сравнению с синтезатором прототипом на 20-30% и ускорить процесс проведения синтеза в 1,3 раза.