способ получения препарата, стимулирующего клеточное дыхание

Формула изобретения

Способ получения препарата, стимулирующего клеточное дыхание, путем ферментативного гидролиза дефибринированной крови телят с последующим выделением целевого продукта методами ультрафильтрации, спиртового осаждения и стерилизующей фильтрации, отличающийся тем, что ферментативный гидролиз проводят с использованием бактериальной эндопротеазы, инактивацию фермента осуществляют нагреванием реакционной смеси до 80 98^oС, после чего балластные вещества с мол.м. выше 5000 8000 Д удаляют добавлением спирта и ступенчатой ультрафильтрацией.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины и касается способа получения препарата, стимулирующего клеточное дыхание. Препараты аналогичного действия в СНГ не производятся, а импортируются из-за рубежа (солкосерил из Швейцарии и актовегин из Австрии).

Известен способ получения веществ, стимулирующих клеточное дыхание. Способ включает дефибринирование и гемолиз телячьей крови с последующим отделением веществ с мол.м. выше 8000 Д многоступенчатой ультрафильтрацией и частичного отделения неорганических веществ электродиализом. Биологическая активность полученного продукта находится на уровне коммерческих препаратов солкосерила (стимуляция поглощения O₂ не более, чем на 10% по сравнению со стандартным образцом).

Описанный способ позволяет получать полуфабрикат для производства препарата типа солкосерил, т.к. в нем не контролируется содержание белков, осаждаемых ТХУ (трихлоруксусной кислотой) и содержание дериватов гемоглобина (по реакции с O-толуидином). В технологическом отношении способ является трудоемким, требует использования сложной аппаратурной схемы. Большая длительность процесса 4-х ступенчатой ультрафильтрации (36 ч) приводит к необходимости использования больших количеств консервантов и их последующему удалению, что сопровождается дополнительным образованием солей.

Наиболее близким по совокупности существенных признаков и достигаемому эффекту является способ получения препарата, обладающего ранозаживляющим действием. В процессе его получения дефибринированную кровь молодых бычков или телят подвергают ферментативному гидролизу папаином при рН 6,5 7,4. Реакцию прекращают холодной водой. Фермент удаляют из реакционной смеси ультрафильтрацией с использованием фильтрующих элементов с порогом отсечения 10000 Д. Фильтрат концентрируют, смешивают со спиртом, выдерживают в течение 24 часов и фильтруют. Длительность всего процесса составляет более 40 часов.

Способ позволяет получить препарат с более выраженной биологической активностью (стимулирование поглощения O₂ составило 30% по сравнению со стандартным образцом), что, по-видимому, связано с проведением дополнительной стадии ферментативного гидролиза. Однако, используемый для гидролиза фермент папаин обладает низкой ферментативной активностью. Для поддержания его биологической активности добавляют большое количество высокоочищенного цистеина и увеличивают продолжительность стадии гидролиза до 15 часов. Необходимо отметить также, что папаин фермент растительного происхождения и импортируется в страны СНГ из-за рубежа. Данные о выходе целевого продукта и содержании в нем общего и аминного азота в описании не приведены.

Цель изобретения повышение биологической активности препарата, сокращение длительности процесса его получения.

С этой целью получение препарата, стимулирующего клеточное дыхание, проводят путем ферментативного гидролиза дефибринированной крови телят с использованием фермента бактериальной эндопротеазы, инактивацию фермента осуществляют нагреванием реакционной смеси до 80 98^oC, затем из смеси удаляют вещества с молекулярной массой выше 5000 8000 Д добавлением спирта и ступенчатой ультрафильтрацией.

Сравнение предлагаемого способа с известным показывает, что общими существенными признаками для них являются: ферментативный гидролиз дефибринированной крови телят с последующим выделением целевого продукта ультрафильтрацией, спиртовым осаждением и стерилизирующей фильтрацией. Однако, в отличие от прототипа, в заявляемом способе для ферментативного гидролиза используют другой фермент бактериальную эндопротеазу с широкой субстратной специфичностью, что позволяет повысить биологическую активность конечного продукта и сократить длительность процесса гидролиза. Изменение последовательности стадий осаждения спиртом и ультрафильтрации позволяет ускорить процедуру отделения балластных веществ и более эффективно использовать ультрафильтрационное оборудование.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Дефростированную или свежую плазму крови телят без следов гемоглобина и фибрина подвергают гидролизу сериновой эндопептидазой при температуре от 30^o до 50^oC в течение 3 5 часов. По окончании гидролиза реакционную массу при перемешивании нагревают до температуры 80 98^oC и выдерживают 20 60 минут. После охлаждения до комнатной температуры в раствор добавляют этиловый спирт и через 16 часов инкубации смесь фильтруют для отделения денатурированных белков. От фильтрата отгоняют спирт. Концентрат последовательно фильтруют через мембранные фильтры с молекулярной массой отсечения 100 кД и 15 10 кД. После фильтрации проводят окончательное упаривание смеси до 1/5 1/6 первоначального объема сыворотки и фильтруют через фильтры с молекулярной массой отсечения веществ 5 8 кД. Для приготовления лекарственной формы препарата, после добавления консерванта, проводят стерилизующую фильтрацию на мембранных фильтрах с диаметром пор 0,22 мкм.

Биологическая активность препаратов изучалась полярографическим методом с использованием закрытого кларковского электрода на изолированных гепатоцитах крыс.

В прототипе биологическая активность препаратов оценивалась на аппарате Варбурга по стимулированию поглощения O₂ гомогенатом печени в процентах по отношению к стандарту солкосерила. В настоящее время этот метод заменен более современным полярографическим методом. Для сопоставимости результатов определения биологической активности в способе прототипе и в заявляемом способе в качестве контрольного образца использован стандарт солкосерила.

Пример 1. Дефростированную или свежую сыворотку крови телят в количестве 1 л помещают в роторный испаритель с мешалкой и обратным холодильником, добавляют 450 мл дистиллированной воды. Смесь нагревают до 392^oC. После окончания ферментативного гидролиза для инактивации протеазы смесь нагревают до температуры 952^oС и выдерживают 20 минут при постоянном перемешивании. Затем смесь охлаждают до температуры 182^oC.

К гидролизату сыворотки крови добавляют 5,25 л этилового спирта. Смесь перемешивают в течение 10 минут, затем переносят в холодильник и оставляют при температуре 52^oC в течение 14 16 часов. Выпавший осадок отделяют фильтрованием через слой фильтровальной бумаги и отбрасывают. Спиртовой раствор гидролизата сыворотки крови нагревают до температуры 55 5^oC в роторном испарителе и при остаточном давлении 7 10 КПа осуществляют отгон водно-спиртовой смеси до конечного объема, равного 1700 мл. Полученный концентрат последовательно фильтруют через мембранные фильтры с молекулярной массой отсечения веществ 100 кД и 15 кД.

После фильтрации проводят упаривание фильтрата в роторном испарителе при температуре 555^oC и давлении 7 10 КПа. Отгон водно-спиртовой смеси проводят до объема 185 мл. Фильтрат собирают и проводят ультрафильтрацию на установке с полыми волокнами с молекулярной массой отсечения 5 кД. Выход 150 мл с содержанием общего азота 2,53 мг/мл и аминного азота 0,9 мг/мл (таблица 1).

Субстанцию препарата получают добавлением 0,150 г консерванта нипагина к 150 мл фильтрата, смесь выдерживают при 50^oC, постоянно перемешивая, до полного растворения нипагина. После чего проводят стерилизующую фильтрацию на мембранных фильтрах с размером пор 0,22 мкм. Раствор препарата в стерильных асептических условиях разливают в ампулы объемом 1 10 мл. Ампулы запаивают.

Пример 2. Ферментативный гидролиз сыворотки крови телят проводят, как в примере 1. После окончания гидролиза смесь нагревают до температуры 852^oC и выдерживают 40 минут при постоянном перемешивании. Затем смесь охлаждают до комнатной температуры.

К гидролизату сыворотки крови добавляют 6 л этилового спирта. Смесь перемешивают в течение 10 минут, затем переносят в холодильник и оставляют при температуре 0^oC в течение 14 16 часов. Выпавший осадок отделяют фильтрованием и отбрасывают. От фильтрата отгоняют спирт в роторном испарителе до конечного объема 1600 мл. Полученный концентрат последовательно фильтруют через мембранные фильтры с молекулярной массой отсечения веществ 100 кД и 10 кД.

После фильтрации проводят упаривание фильтрата в роторном испарителе до 1/5 объема исходной сыворотки. Фильтрат собирают и проводят ультрафильтрацию на установке с полыми волокнами с молекулярной массой отсечения 8 кД. Выход

150 мл с содержанием общего азота 1,85 мг/мл и аминного азота 0,96 мг/мл (таблица 1).

Субстанцию препарата получают, как в примере 1.

Биологическая активность полученных гидролизатов представлена в таблице 2.

Как видно из таблицы, добавление к изолированным гепатоцитам стандарта (солкосерила) и полученного гидролизата приводит к активации потребления или кислорода, при этом полученный препарат обладал в 2 раза большей активностью по сравнению со стандартом солкосерила или на 70% выше активности препарата, полученного по способу-прототипу.

Заявляемый способ обеспечивает получение целевого продукта, не содержащего в своем составе белков (о чем свидетельствует отрицательная реакция с ТХУ), гемоглобина и продуктов его гидролиза (отрицательная реакция с O-толуидином) и характеризуется высокой биологической активностью и высоким выходом конечного продукта. Длительность процесса получения препарата составляет 24 26 часов.