способ получения аффинного сорбента для выделения с- реактивного белка

Формула изобретения

Способ получения аффинного сорбента для выделения С-реактивного белка, включающий взаимодействие замещенной агарозной матрицы с лигандом на основе sn-глицеро-3-фосфохолина с последующей промывкой, отличающийся тем, что в качестве замещенной агарозной матрицы используют аминозамещенную агарозу, в качестве лиганда используют гликольфосфохолин при их соотношении 1,0 0,042 соответственно и взаимодействие проводят при pH 8,2 8,4.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно, к способам получения диагностических препаратов и может быть использовано в медицине.

Известен способ получения аффинного сорбента для выделения С-реактивного белка (СРБ) путем присоединения n-диазонийфенилфосфохолина к модифицированной дипептидом глицилтирозин BrCN-активированной сефарозе 4В (1, 2).

К 20 мМ диметилэтаноламина в 10 мл эфира добавляют 2 мМ метилиодида, смесь перемешивают в течение 18 часов, добавляют 2 мМ n-нитрофенилдихлоридата и 2 мМ хинолина, растворенных в 0,5 мл ацетонитрила каждый, перемешивают в темноте при 0^oC в течение 4-8 часов. После чего в смесь добавляют 1 мл пиридина, 0,2 мл дистиллированной воды, выдерживают 30 минут и упаривают. Сухой остаток растворяют в дистиллированной воде, пропускают через колонку содержащую 40 мл смолы Amberlite МВ-3, элюируют дистиллированной водой и лиофилизируют.

0,3 мМ полученного n-нитрофенилфосфохолина растворяют в метаноле и выдерживают 1 час при 1 атм Н₂ в присутствии 10 мг 10% Pd/C, затем фильтруют на стеклянном фильтре и упаривают. Остаток немедленно растворяют в 2мл холодной 0,1 н НСl и обрабатывают NaNO ₂ при 15^oC.

К 500 мл BrCN-активированной сефарозы 4В ("Pharmacia") присоединяют 1,8 мМ глицилтирозина ("Sigma"). К гелю добавляют 0,5 мМ синтезированного n-диазонийфенилфосфохолина и перемешивают 20 часов.

Асцитную жидкость пропускают через аффинный сорбент, уравновешенный Ca²⁺-содержащим боратным буфером (рН 8,5), затем гель промывают этим же буфером до достижения близкого к нулю значения оптической плотности при 280 нм, после чего белок элюируют, используя боратный буфер с заменой хлористого кальция на этилендиаминтетрауксусную кислоту.

Однако недостатком данного способа получения аффинного сорбента для выделения СРБ является необходимость предварительного получения тирозинзамещенной матрицы и синтез сложного соединения - n-диазонийфенилфосфохолина.

Наиболее близким по своему техническому решению к предлагаемому способу является способ получения аффинного сорбента для выделения СРБ, заключающийся в присоединении к тиолзамещенной агарозе конъюгата гликольфосфохолина с бычьим сывороточным альбумином (3).

16 мМ кадмиевого комплекса sn-глицеро-3-фосфоолина ("Sigma") переводят в свободную форму с помощью ионообменной смолы AG 501 X-8 (Д). 14 мМ sn-глицеро-3-фосфохолина растворяют в 280 мл дистиллированной воды, добавляют 28 мМ сухого мета-периодата натрия и выдерживают 30 минут, после чего добавляют 28 мМ этиленгликоля и упаривают. Сухой остаток растворяют в 0,1 н уксусной кислоте, помещают на колонку, содержащую Sephadex G-15, элюируют 0,1 н уксусной кислотой. Фракции, содержащие гликольфосфохолин, объединяют и упаривают. 7,3 мМ гликольфосфохолина растворяют в 25 мл 0,2 М фосфатного буфера (рН 7.0), добавляют 14,5 мкМ бычьего сывороточного альбумина и 36,3 мМ цианборогидрида натрия в том же буфере. Смесь инкубируют при 37^oC в течение 24 часов, диализуют против дистиллированной воды, фильтруют и лиофилизируют.

90 г агарозы Тoyoperl HW 65 ("Toyo Soda") промывают дистиллированной водой и суспендируют в 90 мл диглицидилового эфира 1,4-бутандиола и 90 мл 0,6 М NaOH, содержащего 180 мг NaBH₄. Гель перемешивают 8 часов, промывают дистиллированной водой, суспендируют в 270 мл 1, M Na₂S₂O₃, устанавливая рН 7,0 с помощью 1 М HCl, смесь инкубируют 16 часов. Затем гель промывают дистиллированной водой, суспендируют в 270 мл 25 мМ трео-2,3-дигидрокси-1,4-дитандитиола и перемешивают 90 минут при 30^oC. Гель промывают ледяным 0,1 М фосфатным буфером (рН 6,0), содержащим 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты.

10,1 мг конъюгата гликольфосфохолина с бычьим сывороточным альбумином растворяют в 10,1 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 6,0), содержащего 44,1 мг N, N-о-фенилендималеимида, растворенного в 1 мл диметилформамида, смесь инкубируют 90 минут при 37^oC, наносят на колонку с Sephadex G-25, элюируют фосфатным буфером. Фракции, содержащие малеимидированной конъюгат, объединяют.

9 г тиолзамещенного агарозного сорбента суспендируют в объединенном растворе малеимидированного конъюгата гликольфосфохолина с бычьим сывороточным альбумином и перемешивают 10-12 часов при 4^oC.

Колонку с аффинным сорбентом уравновешивают Са²⁺-содержащим фосфатным буфером (рН 7,2), пропускают СРБ-положительную сыворотку, промывают тем же буфером до нулевого значения оптической плотности при 280 нм. С-реактивный белок элюируют с помощью фосфатного буфера (рН 7,2), содержащего этилендиаминтетрауксусную кислоту.

Однако недостатком этого способа получения аффинного сорбента для выделения СРБ является сложность и многостадийность получения фосфохолинсодержащего лиганда и тиолзамещенной агарозы.

Целью изобретения является упрощение получения аффинного сорбента, используемого для выделения С-реактивного белка.

Цель достигается использованием в качестве лиганда гликольфосфохолина, иммобилизованного на аминозамещенной агарозной матрице. Способ получения аффинного сорбента для выделения СРБ на основе гликольфосфохолина и приготовленной или коммерческой аминозамещенной агарозы (фиг.1), а также его применение для выделения СРБ иллюстрируются следующими примерами.

ПРИМЕР 1. Sn-глицеро-3-фосфолин, являющийся исходным соединением для используемого в качестве лиганда гликольфосфохолина, получают из яичного фосфатидилхолина согласно методу (4).

К 3,5 мл 100 мМ водного раствора Sn-глицеро-3-фосфолина добавляют 1 мМ сухого мета-периодата натрия и выдерживают 1-2 часа, добавляют 3 мМ этиленгликоля или глицерина и выдерживают еще 1 час. Раствор упаривают до сухого остатка, растворяют его в 0,1 н уксусной кислоте и наносят на колонку, содержащую Sephadex G-15, элюируют 0,1 и уксусной кислотой. Содержащие гликольфосфохолин фракции объединяют, выход гликольфосфохолина составляет 55-60%

1 г сухой BrCN-активизированной сефарозы 4В ("Pharmacia") суспендируют в 1 мМ HCL, промывают на стеклянном фильтре 0,1 М карбонатным буфером (рН 8,2-8,4). К суспензии агарозы в 3-кратном объеме карбонатного буфера добавляют 3,5 мМ триэтилтетраамина или гексаметилендиамина и перемешивают 10-12 часов. Затем гель промывают карбонатным буфером, суспендируют в 3-кратном объеме карбонатного буфера, добавляют объединенные фракции, содержащие гликольфосфохолин, и перемешивают в течение 10-12 часов. Емкость аффинного сорбента по фосфату составляет 24-28 мкМ/г сухого сорбента.

Пример 2. К 18 мл 50 мМ водного раствора Sn-глицеро-3-фосфохолина добавляют 1,8 мМ сухого мета-периодата натрия, смесь выдерживают 30 минут, после чего добавляют 310 мкл 1 мМ тиосульфата натрия. Разделение реакционной смеси проводят с помощью Sephadex G-15 как указано в примере 1.

2,5 г сухой АН-агарозы 4% ("Кемотех", Эстония) суспендируют в 1 мМ HCl, промывают 0,1 М карбонатным буфером (рН 8,2-8,4), суспендируют в 3-кратном объеме карбонатного буфера, добавляют объединенный раствор гликольфосфохолина и перемешивают 10-12 часов. После иммобилизации лиганда гель снова промывают карбонатным буфером. Емкость аффинного сорбента по фосфату составляет 24-28 мкМ/г сухого сорбента.

ПРИМЕР 3. Для выделения С-реактивного белка колонку, содержащую аффинный сорбент, уравновешивают Ca ²⁺ -содержащим трис-НСl буфером (рН 7,6-8,5), пропускают асцитную жидкость с содержанием СРБ не ниже 20 мкг/мл, промывают сорбент СА ²⁺ -содержащим трис-буфером до нулевого значения оптической плотности при 280 нм. С-реактивный белок элюируют трис-HCl буфером (рН 7,6-8,5) с заменой хлористого кальция на лимоннокислый натрий. Выход 60-75% чистота 90-95%

При анализе проб С-реактивного белка, выделенного с использованием описанных в примерах 1 и 2 сорбентов, с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия выявлена одна полоса, соответствующая по молекулярной массе субъединице С-реактивного белка (фиг.1).

С помощью иммуноэлектрофореза показано, что пробы С-реактивного белка, выделенного с использованием описанных в примерах 1 и 2 сорбентов, реагируют с антисывороткой к нему с образованием одной линии преципитации, при использовании антисывороток к нормальным белкам человека линии преципитации отсутствуют (фиг.2).

Концентрацию выделенного С-реактивного белка определяют при помощи метода радиальной иммунодиффузии по Манчини в модификации Стефани Д.В. с соавт.