набор для идентификации вируса лангат

Формула изобретения

Набор для идентификации вируса Лангат, содержащий дезоксиолигонуклеотиды, обладающие активностью прямого и обратного праймеров в реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции соответственно, имеющие следующую структуру: 5" TTACGATGCTCCCTTTGCCA 3" (прямой праймер) и 5" TGGCTGCCAGATGCCCGACA 3" (обратный праймер).

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, точнее к вирусологии и может быть использовано для индикации и идентификации вируса Лангат.

Известны структуры дезоксиолигонуклеотидов праймеров для реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ПЦР) для высокочувствительного обнаружения вирусов японского энцефалита, Денге, желтой лихорадки, энцефалита Сент-Луис (Eldadah Zavd A. Asher David M. Godec Mark S. et al. J. Med.Virol. 1991. 33. N 4. C. 260-267).

Однако данных по обнаружению вируса Лангат не имеется.

Задача изобретения: повышение точности видовой идентификации флавивирусов за счет использования высокоспецифичных праймеров.

Технический результат: усовершенствование лабораторной диагностики флавивирусов, в частности вируса Лангат.

Для решения задачи на основе данных о нуклеотидной последовательности генома и аминокислотной последовательности полипротеина вируса Лангат ТР-21 (Еланцев) выбирают наиболее перспективные участки генома, получают к ним синтетические дезоксиолигонуклеотиды и исследуют их праймерную активность в реакции обратной транскрипции и ПЦР с вирусами комплекса клещевого энцефалита. В качестве вирусного материала используют РНК, выделенную из мозга больных мышей. Олигонуклеотиды получают фосфитамидным методом на автоматическом синтезаторе, структуру синтезированных олигонуклеотидов подтверждают с помощью метода Максама-Гилберта, затем метят биотином. Амплифицированный фрагмент ДНК идентифицируют по его размеру визуализацией полос размером 100 п.н. окрашиванием этидиумом бромидом после гель-электрофореза, а также с помощью аффинного варианта гибридизационного анализа со специфическими олигонуклеотидными зондами к внутренним районам амплифицированного фрагмента ДНК, иммобилизованными на лавсановой пленке.

В результате была выбрана пара праймеров, эффективно амплифицирующих геном вируса Лангат и имеющих следующую структуру (последовательность 5" - 3"):

прямой праймер TTACGATGCTCCCTTTGCCA

обратный праймер TGGCTGCCAGATGCCCGACA

Пpимер использования заявленных дезоксиолигонуклеотидов праймеров для идентификации вируса Лангат.

I. Синтез олигонуклеотидов

Химический синтез олигонуклеотидов осуществляют любым известным методом, например фосфитамидным. В этом случае используют отечественный автоматический серийный синтезатор "Виктория-4М" производства СКТБ спецэлектроники и автоматического приборостроения СО АН СССР со стандартными программами. В качестве мономеров используют 5" O диметокситритил N - ацилдезоксинуклеотид 3" (P-метил, диизопропиламидо)фосфиты. Тетразол (Fluka) сублимируют при 120^oС (1 мм рт. ст. ацетонитрил/ч и хлористый метилен/ч) перегоняют последовательно над оксидом фосфора (V) и гидридом кальция. Для синтеза каждого олигонуклеотидов используют 30 мг полимера CPG-500 (Fluka) с емкостью по присоединенному нуклеозиду 30-40 мкмоль/мг. Время одного цикла наращивания цепи должно составлять 9 мин. Синтезированные олигонуклеотиды хроматографируют обращенно-фазовым методом с использованием хроматографа (например Altex-332, США) на колонках (4,6 х 250 мм) со смолой Lichorosorb RP-18. Хроматографию олигонуклеотидов проводят двукратно, при этом выход продукта должен составляет 200-100 мкг, а средний выход продукта на стадию в расчете на выделенный продукт должен составлять 88-92%

II. Введение биотиновой метки

В полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл помещают 5"-фосфамид олигонуклеотида в количестве 3х10^-8 10^-7 моль и растворяют в 50 мкл 0,1 М боратного буфера рН 9,2, добавляют 1х10^-6 моль 4-сульфо-3-нитрофенилового эфира биотина, тщательно перемешивают. Реакцию проводят при комнатной температуре в течение 1 ч. Продукт реакции осаждают в 1 мл 2% раствора перхлората лития в ацетоне и затем хроматографируют на колонке (4,6 х 250 мм) со смолой (диаметр пор 10 мкм), например Lichorosorb RP-18, используя градиент концентрации ацетонитрила от 0 до 20% в 0,05 М растворе перхлората лития в ацетоне. Выход биотинилированного продукта должен составлять 80-90% Продукт хранят при температуре -10^oC.

III. Выделение суммарной РНК из исследуемой пробы

В полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл помещают 250 мкл суспензии, приготовленной из исследуемой пробы на растворе Хенкса. Затем к пробе добавляют по 25 мкл 10% раствора додецилсульфата натрия и ЗМ раствора ацетата натрия рН 5,2, перемешивают, вносят 300 мкл подогретого на водяной бане насыщенного водой фенола, рН 5,0-5,2, вновь тщательно перемешивают и инкубируют 15 мин при 60^oС, периодически встряхивая пробирки. Затем пробирки охлаждают при -40^oС в течение 15 мин, центрифугируют при 8000-10000 об/мин в течение 3 мин. После центрифугирования РНК концентрируется в верхней водной фазе. Осторожно отбирают водную фазу (по возможности не захватывая интерфазу), переносят в чистую пробирку, добавляют равный объем смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1), осторожно встряхивают и инкубируют в течение 5 мин при 60^oС или при комнатной температуре. Пробирку охлаждают при -40^oС в течение 5 мин, центрифугируют при 8000-10000 об/мин в течение 3 мин, затем водную фазу переносят в чистую пробирку, добавляют 2,5 объема перегнанного 96% спирта, тщательно перемешивают и помещают не менее чем на один час при -40^oС для охлаждения. Пробу центрифугируют, после чего отсасывают спирт и трижды промывают 70% спиртом, приготовленным из перегнанного. Осадок растворяют в 40 мкл стерильной бидистиллированной воды. На микрохроматографе проверяют чистоту выделения НК и определяют концентрацию РНК.

IV. Реакция обратной транскрипции

В пробирку помещают 20 мкл раствора, содержащего около 1 мкг суммарной РНК, добавляют равный объем 0,125 М раствора KCl, 1 мкл биотинилированного прямого праймера (исходная концентрация 10 о.е. (мл) и инкубируют на водяной бане при 100^oС в течение 3 мин (для денатурации РНК). Затем пробирку со смесью помещают на водяную баню 42^oС на 15 мин (для отжига затравки и матрицы), сразу добавляют 1 мкл фермента обратной транскриптазы (25-50 е.а.) и 10 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 мМ dАТР, 0,5 мМ dТТР, 0,5 мМ dGТР, 0,5 мМ dСТР, 2,5 мМ MnCl₂, 0,15 М трис-HCl рН 8,1. Реакцию обратной транскрипции осуществляют в течение 30 мин при 42^oС, затем пробирки помещают на 1 мин в кипящую баню для инактивации фермента.

V. Полимеразная цепная реакция

По окончании синтеза кДНК к пробе добавляют 1 мкл биотинилированного обратного праймера (исходная концентрация 10 о.е. (мл), 6 мкл Н₂O и 40 мкл реакционной смеси, содержащей 1,3 мМ dАТР, 1,3 мМ dТТР, 1,3 мМ dGТР, 1,3 мМ dСТР, 0,63 мМ MnCl₂, 0,19 М трис-HCl рН 8,2, 0,092 М KCl, 10,2 мМ дитиотриетол, 0,43 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. После отжига затравки и матрицы при 100^oС в течение 1 мин пробирку переносят на водяную баню 50^oС, добавляют 1 мкл термостабильной ДНК-полимеразы (2-5 е.а.) и каплю очищенного парафина для предотвращения испарения. ПЦР ведут в следующем режиме: 95^oС 0,6 мин (денатурация), 55^oС 1 мин (отжиг матрицы и праймеров), 70^oС 2 мин (ферментативная реакция). Всего осуществляют 25 таких циклов.

Исследуемые образцы (амплифицированный фрагмент ДНК) денатурируют в присутствии 0,2 H NaOH на кипящей бане в течение 5 мин, затем охлаждают во льду; щелочь нейтрализуют добавлением трис-HCl рН 7,5 до конечной концентрации 0,5 М.

VI. Реакция гибридизации

В начале осуществляют предгибридизацию. Активированную лавсановую пленку с пришитыми к ней зондами, комплементарными внутренним районам амплифицированного фрагмента ДНК, блокируют в буфере Б, содержащем 1 М NaCl, 0,05 М трис-HCl рН 7,5 и 100 мкг/мл ДНК молок лосося, на бане с качалкой при 52^oС в течение 1 ч.

Пленку сушат на воздухе, помещают в чашку Петри на смоченную в гибридизационном буфере фильтровальную бумагу и наносят денатурированные пробы ДНК по 1,5-2,0 мкл. Реакцию гибридизации проводят при 52^oС в течение 30 мин на бане с качалкой. Затем пленку отмывают трижды по 20 мин при комнатной температуре с помощью буфера А, содержащего 0,5 М NaCl, 0,1 М трис-HCl рН 7,5, 0,05% твин-20. Далее осуществляют блокировку пленки в растворе 1% желатина и 0,2% казеина в буфере А в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем в этот раствор добавляют конъюгат стрептавидин-щелочная фосфатаза (конечная концентрация 1,5 мкг/мл) и инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Отмывку пленки от остатков непрореагировавшего конъюгата осуществляют в растворе 1% желатина и 0,2% казеина в буфере А трижды по 10 мин и дважды по 30 мин при комнатной температуре.

Для проявления пленки навески 0,5 мг 5-бром-4-хлор-индолил фосфата и 1,0 мг нитротетразолиевого синего растворяют каждый в отдельной пробирке в 10 мкл диметилформамида и вносят в 2,5 мл буфера, содержащего 0,1 М трис-HCl рН 9,0, 1 мМ MgCl₂, 0,1 мM ZnCl₂, 0,1 M NaCl, в эту смесь помещают пленку и оставляют на ночь в холодильнике на +4^oС. По окончании проявления пленку промывают водой.

В качестве положительного контроля используют РНК, выделенную из мозга мышей, зараженных лабораторным штаммом вируса Лангат, в качестве отрицательного РНК мозга интактных мышей. Постоянными отрицательными контролями также служат биотинилированные праймеры, которые наносят на плену в количестве 1 мкл (концентрация 10 о.е. (мл). Появление окраски, соответствующее накоплению продукта реакции фермента с нитротетразолиевым синим и 5-бром-4-хлор-индолилом, свидетельствует о присутствии РНК вируса лангат в исследуемом образце.

VII. Гель-электрофорез

Для приготовления геля используют 1,5% раствор агарозы 11 в трис-боратном буфере: 50 мМ раствора триса, 50 мМ раствор борной кислоты, 2,25 М раствор натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, рН 8,3-8,4. Этот же буфер с добавлением флюоресцирующего красителя бромистого этидия (0,5 мкг/мл) используют для электрофореза.

Исследуемые пробы в количестве 4 мкл смешивают с 2 мкл буфера, содержащего 0,25% бромфенилового синего в 30% глицерине и вносят в лунки геля под электрофорезный буфер. Для определения длины амплифицированного фрагмента ДНК, в лунку вносят маркер, например, MspI гидролизат плазмиды pIz18U, имеющий набор фрагментов ДНК размером 711, 487, 404, 327, 242, 190, 147, 113, 110, 67, 34 и 26 п.н. По окончании электрофореза визуализацию амплифицированного фрагмента ДНК осуществляют по его размеру в 100 п.н. на приборе с источником УФ-излучения.

Заявляемые праймеры апробированы в реакции обратной транскрипции и ПЦР с РНК вирусов комплекса клещевого энцефалита: клещевого энцефалита, шотландского энцефаломиелита овец, Негиши, кьязанурской лесной болезни, омской геморрагической лихорадки и Лангат (ТР-21). Праймеры инициировали указанные реакции только с геномом вируса Лангат.