способ индикации возбудителя туляремии

Формула изобретения

Способ индикации возбудителя туляремии, включающий введение суспензии исследуемого материала животным с последующим взятием патологического материала, изготовлением мазков-отпечатков, их фиксацией, нанесением флуоресцирующих иммуноглобулинов и учетом результатов при люминесцентном микроскопическом исследовании, отличающийся тем, что белым мышам подкожно в область спины вводят 0,5 1,0 мл суспензии в физрастворе исследуемого материала, которую предварительно смешивают с гепаринизированной кровью морской свинки в соотношении 1 0,5 0,7, к полученной смеси добавляют 0,5 - 0,7 мл желтка куриного яйца, 5 7 мг кортизона и 0,1 0,15 мг адреналина гидрохлорида, а патологический материал для исследования берут с места введения.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологии, в частности к специфической индикации биологических средств методом флуоресцирующих антител (ФА).

Известен бактериологический метод обнаружения возбудителя туляремии путем посева исследуемого материала на питательные среды для выращивания возбудителя туляремии ("Туляремия" под редакцией члена-корреспондента АМН СССР Н.Г.Олсуфьева и акад. АМН Г.П.Руднева, Москва, 1960, с. 285).

Недостатками этого метода являются невозможность исследования иксодовых клещей, воды, почвы, смывов с пищевых продуктов ввиду загрязнения их посторонними бактериями, заглушающими рост микроба туляремии.

Наиболее близким к изобретению является биологический метод индикации возбудителя туляремии, заключающийся во введении инфицированного материала нескольким белым мышам, которых умерщвляют в первые дни после заражения, вскрывают и делают мазки-отпечатки из регионарного лимфатического узла и селезенки для люминесцентной микроскопии (Н.Г.Олсуфьев. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. Москва, 1975, с. 137-138).

Недостатками этого способа являются длительные сроки исследования (до 3-4 суток) и необходимость использования для опытов большого количества животных.

Целью изобретения является повышение чувствительности биологического метода обнаружения возбудителя туляремии.

Сущность изобретения заключается в том, что биопробным животным (белые мыши) подкожно в область спины вводят 0,5-1 мл суспензии в физрастворе исследуемого материала, которую предварительно смешивают с гепаринизированной кровью морской свинки в соотношении 1:0,5-1:0,7, к полученной смеси из расчета на одно животное добавляют 0,5-0,7 мл желтка куриного яйца, 5-7 мг кортизона и 0,1-0,15 мг адреналина гидрохлорида. Исследованию подвергают только место введения, мазки-отпечатки которого фиксируют по общепринятой методике, окрашивают флуоресцирующими иммуноглобулинами, полученные результаты учитывают при люминесцентном микроскопическом исследовании.

Отличительные признаки, в частности добавление к исследуемой пробе желтка куриного яйца, гепаринизированной крови морской свинки и кортизона создают оптимальные условия для размножения и накопления возбудителя туляремии только на месте введения, в результате отпадает необходимость в исследовании всех внутренних органов биопробных животных, что сокращает объем работы и ускоряет выдачу результатов исследования.

Добавление к исследуемой пробе адреналина гидрохлорида вызывает сужение сосудов кожи, подкожной клетчатки и скелетной мускулатуры на месте введения, что способствует локальному накоплению туляремийных бактерий и ускоряет идентификацию указанного возбудителя.

Способ подкожной инокуляции в область спины дает возможностью вводить исследуемый материал белой мыши в значительных объемах (до 2-3 мл), что позволяет одновременно проводить контроль на наличие ботулотоксина.

Таким образом, применение предлагаемого способа позволяет обнаружить возбудителя туляремии при его минимальной концентрации в исследуемом материале.

Исходя из вышеизложенного можно сделать вывод о соответствии предполагаемого изобретения изобретательскому уровню.

Способ осуществляется следующим образом. Исследуемый материал в количестве 0,5-1 мл смешивают с гепаринизированной кровью морской свинки в соотношении 1: 0,5-1:0,7, к полученной смеси добавляют 0,5-0,7 мл желтка куриного яйца, а также адреналин гидрохлорид и гидрокортизон из расчета 0,1-0,15 мг и 5-7 мг соответственно на одно животное. (Данные количественных соотношений приведены в табл. 1). При необходимости к указанной смеси добавляют противоботулиническую сыворотку. Полученную суспензию набирают в шприц и вводят 2-м белым мышам подкожно в область спины. При этом помощник фиксирует животное, а экспериментатор пинцетом захватывает кожу в складку в области крестца и вводит иглу под контролем глаза так, чтобы срез иглы был на уровне лопаток. После этого плавным движением надавливая на поршень, вводят нужное количество материала.

Павших белых мышей, зараженных исследуемым материалом, вскрывают немедленно, живых убивают эфиром или хлороформом на 1 и 2 сутки после заражения. Павших или забитых грызунов прикрепляют к вскрывочной доске приколышами спиной кверху. Кожу над крестцом животного захватывают хирургическим пинцетом, приподнимают вверх, делают маленький поперечный разрез ножницами, в образовавшееся окошечко вводят закругленную браншу ножниц и делают дугообразные разрезы кожи, обходя по бокам место введения. Образовавшийся лоскут кожи (в виде фартука) откидывают на голову грызуна. При этом легко обнаруживают место введения за счет пропитывания мягких тканей кровью. Из места введения делают мазки-отпечатки, которые фиксируют в хлороформе в течение 10 минут и окрашивают туляремийной люминесцирующей сывороткой. Часть мазков окрашивают по Граму.

П р и м е р N 1.

Из расчета на одно животное берут 0,5 мл исследуемого материала, смешивают его с гепаринизированной кровью морской свинки в соотношении 1:0,5, к полученной смеси добавляют 0,5 мл желтка куриного яйца, 5 мг кортизона и 0,1 мг адреналина гидрохлорида. Приготовленную смесь набирают в шприц и вводят под кожу спины 2-м белым мышам. По одной мыши вскрывают на 1 и 2 сутки после введения исследуемой пробы. С места введения делают мазки-отпечатки, фиксируют их 10 мин в хлороформе и окрашивают люминесцирующей туляремийной сывороткой.

Исследование приготовленных препаратов под люминесцентным микроскопом позволяет выявить возбудителя туляремии при его концентрации 10⁹-10² и 10¹ м.кл. в 1 мл соответственно на 1 и 2 сутки.

П р и м е р N 2.

Из расчета на одно животное берут 0,7 мл исследуемого материала, смешивают его с гепаринизированной кровью морской свинки в соотношении 1:0,6, к полученной смеси добавляют 0,6 мл желтка куриного яйца, 6 мг кортизона и 0,12 мг адреналина гидрохлорида. Приготовленную смесь набирают в шприц и вводят под кожу спины 2-м белым мышам. По одной мыши вскрывают на 1 и 2 сутки после введения исследуемой пробы. С места введения делают мазки-отпечатки, фиксируют их в хлороформе и окрашивают люминесцирующей туляремийной сывороткой.

Исследование приготовленных препаратов под люминесцентным микроскопом позволяет выявить возбудителя туляремии при его концентрации 10⁹-10² и 10¹ м.кл. в 1 мл соответственно на 1 и 2 сутки.

П р и м е р N 3.

Из расчета на одно животное берут 1,0 мл исследуемого материала, смешивают его с гепаринизированной кровью морской свинки в соотношении 1:0,7, к полученной смеси добавляют 0,7 мл желтка куриного яйца, 7 мг кортизона и 0,15 мг адреналина гидрохлорида. Приготовленную смесь набирают в шприц и вводят под кожу спины 2-м белым мышам. По одной мыши вскрывают на 1 и 2 сутки после введения исследуемой пробы. С места введения делают мазки-отпечатки, фиксируют их 10 мин в хлороформе и окрашивают люминесцирующей туляремийной сывороткой.

Исследование приготовленных препаратов под люминесцентным микроскопом позволяет выявить возбудителя туляремии при его концентрации 10⁹-10² и 10¹ м.кл. в 1 мл соответственно на 1 и 2 сутки.

Результаты представлены в таблице N 2.

Использование заявляемого способа, в частности введение исследуемого материала биопробным мышам вместе с желтком куриного яйца, гепаринизированной кровью морской свинки, адреналином гидрохлоридом и кортизоном вызывает задержку, размножение и накопление туляремийного микроба только на месте введения. При этом резко повышается чувствительность биологического метода. Так, иммунофлуоресцентным методом возбудитель туляремии при его концентрации 10⁹-10² м. кл. в 1 мл может быть обнаружен на 1 сутки, при концентрации 10¹ м. кл. в 1 мл на 2 сутки от начала исследования. Локальное размножение и накопление возбудителя позволяют исследовать только место введения и исключают исследование других органов и тканей биопробных животных, что резко сокращает объем работ и ускоряет выдачу результатов исследования. Высокая чувствительность и надежность метода, только 2 срока исследования (24 и 48 ч), позволяют сократить количество биопробных животных до 2-х. Способ введения исследуемых проб (под кожу спины) дает возможность исследовать большие объемы проб (1 мл), а также вводить другие компоненты, например противоботулиническую сыворотку.