штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus l., используемый для получения моноклональных антител к с- концевой части белка р 24 вируса иммунодефицита человека типа i

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L. ВСКК(П) N 484Д, используемый для получения моноклональных антител к С-концевой части белка р 24 вируса иммунодефицита человека типа 1.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а точнее к медицинской вирусологии и касается получения моноклональных антител (МА) к белку р24 вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1), которые могут быть использованы для тестирования белка р24 и антител к нему в медицинских, научно-исследовательских и биотехнологических целях.

Известен ряд зарубежных патентов, в которых защищаются гибридомы, продуцирующие МА к белку р24 ВИЧ-1 [1,2] Однако из описания этих патентов не ясно, способны ли МА, продуцируемые защищаемыми гибридомами, связывать вирусный белок р24 из раствора после сорбции их на твердую фазу. Это свойство МА представляется принципиальным, поскольку, по нашим данным, многие МА теряют активность после сорбции их на планшетах, что не позволяет использовать их в качестве иммуносорбента для количественного определения содержания белка р24 в биологических жидкостях. Наиболее близким техническим решением является гибридома АТСС НВ 9725, полученная Abbott Laboratories в 1989 г. К сожалению, в настоящее время прямое сравнение заявляемого объекта с прототипом в лабораторных условиях не представляется возможным, поэтому мы пользовались опубликованными данными [3] Гибридома АТСС НВ 9725, полученная путем снятия спленоцитов иммунных мышей BALB/c с миеломными клетками SP2/0, секретирует МА 31-90-25 IgG2a класса, распознающие антигенную детерминанту, присутствующую на белке р24 ВИЧ-1 и отсутствующую на ВИЧ-2. Эта антигенная детерминанта находится на N-концевой части белка р24. МА 31-90-25 способны связывать белок р24 из раствора после сорбции их на твердую фазу. В том же патенте защищается также гибридома АТСС НВ 9726, продуцирующая МА 31-42-19, которые не являются типоспецифическими и перекрестно реагируют с белком р24 вирусов иммунодефицита человека 1-го и 2-го типов.

Задачей изобретения является получение гибридных клеток, секретирующих моноклональные антитела (МКА), взаимодействующих с С-концевой частью белка р24, не обладающих перекрестной реактивностью с антигенами ВИЧ-2, эффективно сорбирующихся на поверхность полистироловых планшет для иммунологических реакций, способных эффективно захватывать из раствора белок р24 ВИЧ-1 и иммобилизовать его на твердой фазе полистироловых планшет за С-концевую часть белка р24. Решение задачи изобретения позволит сконструировать новое поколение тест систем на белок р24 ВИЧ-1. Главное отличительное свойство этих систем будет состоять в том, что белок р24 будет эффективно захватываться из биологических жидкостей и иммобилизоваться на твердую фазу. При этом большинство антигенных детерминант данного белка, располагающихся на N-концевой части белка р24, будет доступно для взаимодействия с индикаторными антителами, используемыми для выявления иммунного комплекса на поверхности твердой фазы. Это должно позволить увеличить чувствительность и специфичность данных тест систем, имеющих важное значение для диагностики и правильного лечения заболевания, вызываемого ВИЧ-1.

Сформулированная задача достигается снятием клеток мышиной миеломы Р3 NS1/1-Ag4.1 с клетками селезенки мышей BALB/c, иммунизированных лизатом клеток МТ-4, инфицированных ВИЧ-1 (штамм ГКВ N 4005). Полученная гибридома ВСКК/П/484Д, депонированная 14.05.90, продуцирует МА NS5E4, которые являются типоспецифическими для ВИЧ-1 и не связываются с ВИЧ-2. МА NS5E4, сорбированные на твердой фазе, эффективно связывают белок р24 из раствора и успешно применяются в разработке диагностических тест-систем для определения содержания белка р24 ВИЧ-1 в биологических жидкостях, а также для решения других научно-исследовательских задач. В отличие от штамма-прототипа заявляемая гибридома происходит от другой мышиной миеломной клеточной линии NS-1, а также продуцирует МА, связывающиеся с другой антигенной детерминантой на С-концевой части молекулы белка р24 ВИЧ-1. По литературным данным С-концевая область белка р24 ВИЧ-1 более консервативна, чем N-концевая [5] что также важно учитывать при создании диагностических тест-систем, основанных на МА.

Штамм-продуцент МКА получают следующим образом. Для иммунизации используют самок мышей BALB/c. Схема иммунизации включает внутрибрюшинное введение лизата клеток МТ-4, инфицированных ВИЧ-1 [4] трехкратно в дозе 200 мкг белка на мышь с полным адъювантом Фрейнда. Интервал между иммунизациями составляет 2 недели. За 3 суток до слияния животным вводят по 200 мкг лизата внутривенно в физиологическом растворе. Мышей забивают с помощью хлороформа и извлекают в стерильных условиях селезенки, из которых готовят клеточную суспензию.

В качестве партнера для слияния используют мышиную миелому Р3 NS 1/1-Ag4.1 (NS-1). Для слияния берут 400 млн селезеночных клеток и 80 млн клеток NS1. Смесь клеток центрифугируют, супернатант тщательно удаляют и к клеточному осадку добавляют 0,5 мл 50% раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 2000.

Смесь центрифугируют 4 мин при 600 g. Через 8 мин слой ПЭГ медленно растворяют раствором версена, после чего осадок ресуспендируют и центрифугируют. Клетки распределяют в 10 культуральных микроплат. Селекцию гибридных клеток проводят в среде НАТ, состоящей из питательной среды ДМЕМ(М), в которую добавляют 20% фетальной сыворотки коров, 0,1 мМ гипоксантина, 0,04 мМ тимидина и 0,01 мМ аминоптерина.

Отбор гибридом проводят методом твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА), используя в качестве антигена лизат инфицированных ВИЧ-1 клеток МТ-4, а в качестве контроля -лизат неинфицированных клеток МТ-4. Гибридому NS5E4 трижды клонируют методом предельных разведений, переводят в массовую культуру и замораживают в жидком азоте. Штамм-продуцент характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Культура состоит из крупных округлых клеток, сходных по морфологии и размерам с исходной родительской миеломой NS1. Овальное ядро расположено эксцентрично и занимает значительную часть цитоплазмы.

Культуральные свойства. Среда для культивирования среда Игла МЕМ в модификации Дульбекко, содержащая увеличенные количества аргинина до 200 мг/л, фолиевой кислоты до 12 мг/л, аспарагина до 36 мг/л, а также 0,05 мМ 2-меркаптоэтанола и 20 мМ HEPES. Содержание фетальной сыворотки в ростовой среде 15% В среду также добавляют 1 мкг/мл сульфата гентамицина. Гибридома NS5E4 растет в виде монослойно-суспензионной культуры. Посевная доза 100 200 тыс. клеток в миллилитре, кратность рассева 1:3 1:4.

Культивирование гибридомы в организме животного. Самок мышей BALB/c сенсибилизируют внутрибрюшинным введением 0,5 мл пристана. Через 2 4 недели животным вводят внутрибрюшинно по 5 млн гибридных клеток. Через 10 12 дней формируется асцитная опухоль. От одного животного можно получить 2 5 мл асцитической жидкости. Гибридома прививается в 100% случаев.

Характеристика полезного продукта. Методом иммунопреципитации в геле с набором коммерческих типирующих антисывороток было выяснено, что МКА относятся к субклассу IgG2a. Они специфически взаимодействуют с белком р24 ВИЧ-1 в реакции иммуноблотинга, способны работать в качестве иммуносорбента и связывать белок р24 из раствора. МКА являются типоспецифическими для ВИЧ-1 и не связываются с антигенами ВИЧ-2. Титр МКА в ТИФА составляет 1:3000 для культуральной жидкости и 1:200000 для асцита. Стабильная продукция МКА сохраняется на протяжении не менее 30 пассажей in vitro.

Криоконсервирование. Среда для замораживания среда ДМЕМ(М) 50% фетальная сыворотка 40% диметилсульфоксид 10% 0,5 мл клеточной суспензии переносят в пластиковые криопробирки и помещают в пенопластовый контейнер с толщиной стенок 1,5 см. Контейнер вносят в пары жидкого азота. Через сутки пробирки переносят в жидкий азот. Размораживание проводят, опуская пробирки в воду с температурой 41^oC. Клетки разводят средой ДМЕМ(М) и центрифугируют 5 мин при 600 g. Осадок ресуспендируют в ростовой среде в концентрации 200 - 300 тыс. клеток в миллилитре и переносят в культуральные флаконы. Жизнеспособность после размораживания составляет 60 80% (окраска 0,25%-ным трипановым синим).

Полученная гибридома секретирует моноклональные антитела к антигенной детерминанте, расположенной на С-концевой части белка р24 ВИЧ-1. Эти МА не теряют своей активности после сорбции их на планшетах, способны связывать р24 из раствора и ранее не описаны в литературе.

Получаемые МА находят применение в создании тест-систем для определения инфекции ВИЧ-1.

Таким образом, техническое решение обладает всеми признаками патентоспособности, а именно новизной, изобретательским уровнем и промышленной применимостью.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами.

Фиг. 1. Иммуноблотинг лизата клеток МТ-4, инфицированных ВИЧ-1, 1,11 - положительные человеческие анти-ВИЧ-1 сыворотки; 2 NS6D1; 3 NS4E12; 4 - NS5E4; 5 NS6G11; 6,10 отрицательные мышиная и крысиная сыворотки; 7 - Y3G10; 8 Y5E6; 9 Y9G11. В качестве препаратов МА использовались разведенные 1:500 асцитические жидкости.

Фиг.2. График зависимости оптической плотности от концентрации белка р24 ВИЧ-1. По оси ординат указана оптическая плотность (ОП), измеренная при 492 нм, по оси абсцисс известная концентрация белка р24 ВИЧ-1 в пробе (нг/мл).

Приведенные ниже примеры подробно раскрывают сущность изобретения.

Пример 1. Определение вирусного белка, специфически реагирующего с МКА, синтезируемыми гибридомой NS5E4. Вирусный белок-мишень для МА NS5E4 определяют методом иммуноблотинга [6] Белки лизата клеток МТ-4, инфицированных ВИЧ-1, разделенные электрофорезом в полиакриламидном геле [7] переносят на нитроцеллюлозную мембрану (Millipore, США). Перенос проводят в течение 1,5 часов на аппарате Transphor (LKB, Швеция) при напряжении 80 В в 0,025 М трис-HCl буфере, содержащем 0,192М глицина (рН 8,3) и 20% этанола. Контроль переноса белков на нитроцеллюлозу осуществляют прокрашиванием полоски мембраны амидочерным 10В. Остальные полоски помещают в 10 мМ трис-HCl буфер рН 7,2, содержащий 0,145 М NaCl, 0,05% твин 20 (TBS-твин) и 0,5% казеина на ночь при 4^oC. Обработанные таким образом полоски инкубируют в течение часа при 37^oC с препаратами асцитической жидкости МА в разведении 1:100. От избытка антител избавляются трехкратным промыванием мембран TBS-твин. Далее мембраны обрабатывают кроличьей антисывороткой к мышиным IgG, меченой пероксидазой в разведении 1:200. Выдерживают 2 часа при комнатной температуре. Полоски промывают и проявляют в растворе хромогена, содержащем 1 мг/мл 4-хлор-1-нафтола и 0,03% перекиси водорода в 50 мМ трис-HCl буфере рН 7,4 и 0,145 М NaCl. Взаимодействие МА с вирусными белками проявляется в виде сине-фиолетовых полос (фиг. 1). По данным иммуноблотинга МА NS5E4 взаимодействуют с вирусным белком ВИЧ-1, продуктом гена gag p24, а также с его предшественниками, имеющими молекулярную массу 40 и 55 килодальтон. Минус обозначает отсутствие связывания полосок с нормальной мышиной или крысиной сыворотками. Плюс обозначает связывание полосок с сывороткой человека, инфицированного ВИЧ-1.

Пример 2. Определение способности МА, синтезируемых гибридомой NS5E4, связывать белок р24 ВИЧ-1 из раствора. В лунки полистирольных планшетов вносится по 100 мкл 0,75% -ного раствора бикарбоната натрия, содержащего очищенные МА NS5E4 в концентрации 10 мкг/мл. Антитела сорбируются в течение ночи при 4^oC. Далее планшеты промывают дистиллированной водой и заливают в лунки по 200 мкл 0,5% раствора казеина в воде для связывания на пластике мест неспецифической сорбции. После инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре содержимое планшетов сливают и вносят в лунки по 100 мкл разведений, анализируемых на содержание р24 проб, а также отрицательный контроль. Разведения готовят на 10 мМ трис-HCl буфере рН 7,2, содержащем 0,145 М NaCl, 0,05% твин 20 (TBS-твин) и 0,5% казеина. После инкубации в течение 1 часа при 37^oC планшеты промывают трехкратно раствором TBS-твин. Затем в лунки планшетов добавляют по 100 мкл раствора анти-ВИЧ конъюгата, приготовленного на основе пероксидазы хрена и очищенных IgG, выделенных из сыворотки ВИЧ-инфицированного человека и обладающих высоким титром к ВИЧ-1. Планшеты инкубируют в течение 1 ч при 37^oC, промывают трехкратно TBS-твин и далее образовавшийся комплекс проявляют в растворе хромогена, содержащем 1 мг/мл ортофенилендиамина и 0,03% перекиси водорода в 0,2М фосфатно-цитратном буфере рН 5,5. В каждую постановку реакции включают пробу с известным содержанием р24 ВИЧ-1. Строят для нее зависимость оптической плотности (ОП) от концентрации и по значению ОП исследуемой пробы на графике определяют значение концентрации р24 ВИЧ-1. Чувствительность определения белка р24 в пробах составляет 0,25 0,5 нг/мл. Данные одного такого эксперимента представлены на фиг.2.

Пример 3. Исследование специфичности связывания МА, синтезируемых гибридомой NS5E4. Наличие связывания МА с различными антигенами определяют стандартным методом ИФА, где антигены сорбируют на поверхности лунок иммунологических планшетов, а индикацию связывания МА проводят с использованием меченых пероксидазой антивидовых антител. Образовавшийся комплекс проявляют раствором хромогена, содержащим 1 мг/мл ортофенилендиамина и 0,03% перекиси водорода в 0,2М фосфатно-цитратном буфере рН 5,5. Реакцию останавливают раствором 1N HCl и просчитывают результаты на спектрофотометре Uniscan II (Titertech, Финляндия). При этом в качестве анализируемых проб используют лизаты клеток ТМ-4, инфицированных различными штаммами и изолятами ВИЧ-1 и ВИЧ-2, а в качестве контроля лизат неинфицированных клеток МТ-4. Результаты эксперимента представлены в табл. 1. Из табл. 1 видно, что МА NS5E4 связывается с белком р24 всех 5 исследованных штаммов и изолятов ВИЧ-1 ГКВ N4005, ГКВ N4046, BH10, N1, N10. Отсутствует связывание МА NS5Е4 с 2-мя исследованными штаммами ВИЧ-2 rot и ГВК N4047.

Пример 4. Определение места связывания МА NS5E4 на молекуле белка р24. Ориентировочное место связывания МА NS5E4 на молекуле белка р24 определяют в реакции ИФА, используя в качестве антигенов очищенные продукты трансляции двух фрагментов гена gag, условно обозначенных GAG1 и GAG2. Полипептид GAG1 содержит в своем составе с 1 по 177 аминокислоту (АК), а GAG2 с 78 по 246 АК последовательности белка р24 ВИЧ-1 штамм ВН10. Порядковый номер АК начинается с N-конца белка. Результаты эксперимента представлены в табл.2. Полученные данные говорят о том, что сайту связывания МА NS5Е4 находится в С-концевой части молекулы белка р24 ВИЧ-1 между 78 и 246 АК. Таким образом, полученный на основе мышиной миеломы штамм гибридных клеток NS5E4 продуцирует МА, которые могут использоваться в качестве средства для тестирования наличия белка р24 ВИЧ-1 в биологических жидкостях.

Вышеприведенные свойства штамма гибридных клеток NS5E4 позволяют заключить, что впервые получена гибридома, синтезирующая моноклональные антитела к С-концевой части молекулы белка р24 вируса иммунодефицита человека типа 1, способные эффективно связывать данный белок из раствора.