способ получения растений-регенерантов rauwolfia vomitoria atz.

Формула изобретения

Способ получения растений-регенерантов Rauvolfia vomitoria Atz. в культуре ткани, включающий посадку стерильных эксплантантов на питательную среду для каллусообразования, получение каллуса и перенос его на среду для индукции растений-регенерантов, отличающийся тем, что каллус дополнительно субкультивируют, причем этапы получения каллуса, субкультивирования его и индукции растений-регенерантов осуществляют на среде Мурасиге-Скуга, содержащей макро- и микроэлементы, сахарозу, инозит, а также агар-агар в количестве 5500 6000 мг/л, тиамин 1 2 мг/л, пиридоксин 0,8 1,2 мг/л, никотиновую кислоту 0,8 1,2 мг/л и на этапе каллусообразования в среду дополнительно вводят 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту в количестве 1,5 2,0 мг/л и 6-бензиламинопурин 1,0 2,0 мг/л, а на этапе субкультивирования каллуса в среду вводят дополнительно 0,5 1,5 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии выращивания растений и сельскому хозяйству и может быть использовано для ускоренного массового размножения и получения лекарственного сырья ценных тропических видов, их оздоровления, а также в селекции и в исследованиях по генетике и морфогенезу.

Известен способ почвенной культуры раувольфии рвотной, который включает посев семенами и выращивание растений до полной зрелости [1,2] Однако только около 30% семян является всхожими, поэтому чаще используется способ получения растений раувольфии рвотной с помощью рассады вегетативного размножения стебле-корневых черенков [2]

Прототипом предполагаемого изобретения является биотехнологический способ ускоренного размножения раувольфии седоватой (близкого к раувольфии рвотной вида) in vitro [3] из каллусов листового происхождения на агаризованных питательных средах. Способ заключается в том, что молодые листья растений раувольфии седоватой стерилизуют и помещают на питательную среду для образования каллуса следующего состава, в мг/л: калия нитрат 3600-4000; аммония нитрат 1200-1800; кальция хлорид 80-120; магния сульфат 100-120; калия дигидрофосфат 160-200; агар 5500-6500; сахароза 24000-30000; инозит 80-120; тиамин 6-10; пиридоксин 0,8-1,2; никотиновая кислота - 0,8-1,2; аскорбиновая кислота 1-3; глутамин 15-25; микроэлементы по прописи Мурасиге и Скуга; -нафтилуксусная кислота 1,8-3; 6-бензиламинопурин 1,8-2,0. После образования каллуса отбирают плотные участки ярко-зеленого цвета и пересаживают их на питательную среду для индукции побегов, содержащую, в мг/л: минеральные соли, микроэлементы, сахароза, инозит по прописи Мурасиге и Скуга, агар 5500-6000; глутамин 15-25; тиамин 5-10; пиридоксин 1-1,5; аскорбиновая кислота 2-3; никотиновая кислота 1-1,5; 6-бензиламинопурин 1,5-2,5, и развившиеся побеги размножают микрочеренками.

Однако этот способ не обеспечивает высокого выхода растений-регенерантов. Кроме того этот способ оказался неприемлемым для раувольфии рвотной, что связано со специфическими для каждого вида растений условиями, способствующими получению растений-регенерантов из тканей и клеток, культивируемых in vitro.

Целью предполагаемого изобретения является увеличение выхода растений-регенерантов и ускоренное размножение и оздоровление растений раувольфии рвотной в культуре ткани.

Поставленная цель в способе получения растений-регенерантов раувольфии рвотной в культуре ткани, включающем посадку стерильных эксплантов на питательную среду для каллусообразования, получение каллуса с переносом его на среды для индукции растений достигается тем, что получение каллуса растений осуществляют на модифицированной питательное среде Мурасиге и Скуга, содержащей в мг/л: минеральные соли, микроэлементы, сахароза и инозит по прописи Мурасиге и Скуга; агар 5500-6000; тиамин 1-2; пиридоксин - 0,8-1,2; никотиновая кислота 0,8-1,2; 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота - 1,5-2,0; 6-бензиламинопурин 1-2, с последующим субкультивированием каллуса на модифицированной питательной среде Мурасиге и Скуга, содержащей, в мг/л: минеральные соли, микроэлементы, сахарозу и инозит по прописи Мурасиге и Скуга, агар 5500-6000; тиамин 1-2; пиридоксин 0,8-1,2; никотиновая кислота 0,8-1,2; 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота 0,5-1,5, а индукцию растений проводят на модифицированной среде Мурасиге, содержащей в мг/л: минеральные соли, микроэлементы, сахароза и инозит по прописи Мурасиге и Скуга; агар 5500-6500; тиамин 1-2; пиридоксин 0,8-1,2; никотиновая кислота 0,8-1,2.

Пример 1. Молодые листья растений Rauwolfia vomitoria Afz. моют мылом, промывают водой и стерилизуют активным хлором (раствор пантоцида, либо 5-10% раствор хлорной извести). Затем листья разрезают на фрагменты 0,5х0,5 см, делают насечки по всей поверхности листовой пластинки и помещают на основную питательную среду Мурасиге и Скуга для каллусообразования, в которую дополнительно вводят, в мг/л: агар 5500; тиамин 1; пиридоксин 0,8; никотиновая кислота 0,8; 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота 1,8; 6-бензиламинопурин 1,5. При использовании питательных сред другого состава [4] и прототипа также наблюдали образование каллуса, однако интенсивность его образования была ниже, либо образующийся каллус не был в дальнейшем способен к регенерации растений (табл. 1). Экспланты инкубировали в течение 35-45 дней при температуре 26-28^oC. Из развившихся каллусов отбирают рыхлые каллусы и пересаживают их на модифицированную среду Мурасиге и Скуга для субкультивирования следующего состава, в мг/л: калия нитрат 1800; аммония нитрат 1650; магния сульфат 350; калия дифосфат 150; кальция хлорид - 410; микpоэлементы, железа хелат, инозит, сахароза по прописи Мурасиге и Скуга; тиамин 1; пиридоксин 0,8; никотиновая кислота 0,8; агар 5500; 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота 0,5. Через 30-40 дней полученный каллус переносят для субкультивирования на основную среду Мурасиге и Скуга, дополненную в мг/л: агаром 5500; тиамином 1; пиридоксином 0,8; никотиновой кислотой 0,8; 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой 0,5.

Субкультивирование осуществляют при температуре 26-28^oC при 16-часовом фотопериоде. Выбор среды обосновывается данными табл.2.

Через 20-30 дней полученный эмбриоидогенный каллус переносят на среду Мурасиге и Скуга для развития растений, дополненную, в мг/л: агаром 5500; тиамином 1; пиридоксином 0,8; никотиновой кислотой 0,8.

Пример 2. Подготовленные к культивированию in vitro, как указано в примере 1, молодые листья разрезают на фрагменты и помещают на основную питательную среду Мурасиге и Скуга для каллусообразования, в которую дополнительно вводят, в мг/л: агар 6500; пиридоксин 1,2; тиамин 2; никотиновая кислота 1,2; 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота 2,2; 6-бензиламинопурин 2,2. Экспланты инкубировали при температуре 26-28^oC. Из развившихся каллусов отбирают рыхлые ткани и пересаживают их на модифицированную питательную среду Мурасиге и Скуга для субкультивирования следующего состава, в мг/л: калия нитрат 2000; аммония нитрат 1700; магния сульфат 380; калия дифосфат 180; кальция хлорид 460; микроэлементы, железа хелат, инозит, сахароза по прописи Мурасиге и Скуга; тиамин 2; пиридоксин 1,2; никотиновая кислота 1,2; агар 6000; 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота 1,5. Обоснование отсутствия эффекта за пределами оптимальных концентраций представлено в табл.2.

Через 30-40 дней полученный каллус переносят для дальнейшего субкультивирования на основную среду Мурасиге и Скуга, дополненную, в мг/л: агаром 6000; тиамином 2; пиридоксином 1,2; никотиновой кислотой 1,2; 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой 1,5. Субкультивирование осуществляют при температуре 26-28^oC при 16-часовом фотопериоде. Через 20-30 дней полученный эмбриогенный каллус переносят для развития растений на среду Мурасиге и Скуга, дополненную, в мг/л: агаром 6000; тиамином 2; пиридоксином 1,2; никотиновой кислотой 1,2 (табл.2).

Таким образом, выход растений-регенерантов увеличивается в 1,5-2,0 раза, при этом полученные растения-регенеранты были оздоровленными и морфологически не отличались от исходных растений.

Использование предлагаемого изобретения позволяет ускоренно размножать ценное лекарственное растение-продуцент противоаритмических и гипотензивных препаратов, наиболее высокоалкалоидный из всех видов раувольфии раувольфию рвотную. Весь процесс от получения каллуса до развития растений занимает в среднем 4 мес. Выход растений на 1 исходный каллус составляет более 6000 растений за 6 мес. культивирования. Одновременно растения освобождаются от бактериальной, грибной и вирусной инфекции. В селекционно-семеноводческой работе с раувольфией этот способ позволяет значительно сократить выведение новых сортов.