способ получения препарата, стимулирующего клеточное дыхание

Формула изобретения

Способ получения препарата, стимулирующего клеточное дыхание, путем ферментативного гидролиза дефибринированной крови телят с последующим выделением целевого продукта методами ультрафильтрации, концентрации и стерилизующей фильтрации, отличающийся тем, что ферментативный гидролиз проводят с использованием бактериальной эндопротеазы, инактивацию фермента осуществляют нагреванием реакционной смеси до 80 98°С, после чего балластные вещества с молекулярной массой выше 5000 8000 Д удаляют ступенчатой микро- и ультрафильтрацией.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и касается способа получения отечественного препарата, стимулирующего клеточное дыхание. Препараты аналогичного действия в СНГ не производятся, а импортируются из-за рубежа (солкосерил из Швейцарии, актовегин из Австрии).

Известен способ получения веществ, стимулирующих клеточное дыхание [1] Способ включает дефибринирование и гемолиз телячьей крови с последующим отделением веществ с мол.м. выше 8000 Д многоступенчатой ультрафильтрацией и частичного отделения неорганических веществ электродиализом. Биологическая активность полученного продукта находится на уровне коммерческих препаратов солкосерил (стимуляция поглощения O₂ не более, чем на 10% по сравнению со стандартным образцом).

Описанный способ позволяет получать полуфабрикат для производства препарата типа солкосерил, т.к. в нем не контролируется содержание белков, осаждаемых ТХУ (трихлоруксусной кислотой) и содержание дериватов гемоглобина (по реакции с О-толуидином). В технологическом отношении способ является трудоемким, требует использования сложной аппаратурной схемы. Большая длительность процесса 4-х ступенчатой ультрафильтрации (36 ч) приводит к необходимости использования больших количеств консервантов и их последующему удалению, что сопровождается дополнительным образованием солей.

Наиболее близким по совокупности существенных признаков и достигаемому эффекту является способ получения препарата, обладающего ранозаживляющим действием [2] В процессе его получения дефибринированную кровь молодых бычков или телят подвергают ферментативному гидролизу папаином при рН 6,5 7,4. Реакцию прекращают холодной водой. Фермент удаляют из реакционной смеси ультрафильтрацией с использованием фильтрующих элементов с порогом отсечения 10000 Д. Фильтрат концентрируют, смешивают со спиртом, выдерживают в течение 24 ч и фильтруют. Длительность всего процесса составляет более 40 ч.

Способ позволяет получить препарат с более выраженной биологической активностью (стимулирование поглощения О₂ составляет 30% по сравнению со стандартным образцом), что, по-видимому, связано с проведением дополнительной стадии ферментативного гидролиза. Однако, используемый для гидролиза фермент папаин обладает низкой ферментативной активностью. Для поддержания его биологической активности добавляют большое количество высокоочищенного цистеина и увеличивают продолжительность стадии гидролиза до 15 ч. Необходимо отметить также, что папаин фермент растительного происхождения и импортируется в страны СНГ из-за рубежа. Данные о выходе целевого продукта и содержании в нем общего и аминного азота в описании не приведены.

Цель изобретения повышение биологической активности препарата, сокращение длительности процесса его получения.

С этой целью получение препарата, стимулирующего клеточное дыхание, проводят путем ферментативного гидролиза дефибринированной крови телят с использованием фермента бактериальной эндопротеазы, инактивацию фермента осуществляют нагреванием реакционной смеси до 80 98^oC, затем из смеси удаляют вещества с молекулярной массой выше 5000 8000 Д с помощью ступенчатой ультрафильтрации.

Сравнение предлагаемого способа с известным показывает, что общими существенными признаками для них являются: ферментативный гидролиз дефибринированной крови телят с последующим выделением целевого продукта с использованием ультрафильтрации, концентрации упариванием и стерилизующей фильтрации. Однако, в отличие от прототипа, в заявляемом способе для ферментативного гидролиза используют другой фермент бактериальную эндопротеазу с широкой субстратной специфичностью, что позволяет повысить биологическую активность конечного продукта и сократить длительность процесса. Исключение стадии осаждения спиртом позволяет ускорить процедуру отделения веществ и сократить таким образом длительность технологического процесса. Введение тепловой инактивации фермента с последующей его денатурацией позволяет применить микрофильтрацию для удаления эндопротеазы и высокомолекулярных полипептидов из реакционной смеси. Частичное удаление полипептидов ускоряет последующую ультрафильтрацию.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Дефростированную или свежую плазму крови без следов гемоглобина и фибрина подвергают гидролизу сериновой эндопептидазой при температуре от 30 до 50^o в течение 3 5 ч. По окончании гидролиза реакционную массу при перемешивании нагревают до температуры 80 98^oC и выдерживают 20 60 мин. После охлаждения до комнатной температуры проводят последовательную микро- и ультрафильтрацию через мембранные установки с диаметром пор 0,5 мкм и с порогом отсечения 100 кД и 5 10 кД. Фильтрат упаривают до 1/5 1/6 первоначального объема и повторно проводят ультрафильтрацию через фильтры с порогом отсечения веществ 5 10 кД. Для приготовления лекарственной формы препарата, после добавления консерванта, проводят стерилизующую фильтрация на мембранных фильтрах с диаметром пор 0,22 мкм.

Биологическая активность препарата изучалась полярографическим методом с использованием закрытого кларковского электрода на изолированных гепатоцитах крыс.

В прототипе биологическая активность препаратов оценивалась на аппаратуре Варбурга по стимулированию поглощения О₂ гомогенатом печени в процентах по отношению к стандарту солкосерила. В настоящее время этот метод заменен более современным полярографическим методом. Для сопоставимости результатов определения биологической активности, полученных в прототипе и заявляемом способе, в качестве контрольного образца использован стандарт солкосерила.

Пример 1. Дефростированную или свежую сыворотку крови телят в возрасте до 6 месяцев в количестве 1000 мл и 400 мл дистиллированной воды помещают в реактор. Температура смеси 392^oC. В смесь добавляют 50 мг сериновой эндопротеазы. Ферментативный гидролиз белков сыворотки крови проводят при постоянном перемешивании при температуре 422^oC в течение 4 ч. Затем смесь нагревают до 952^oC и выдерживают при этой температуре 40 мин. Смесь охлаждают до комнатной температуры. Смесь фильтрат через мембранные фильтры с диаметром пор 0,5 мкм для отделения денатурированных белков. Затем проводят последовательную ультрафильтрацию фильтрата на мембранных установках с молекулярной массой отсечения веществ 100 кД и 98 кД. Полученный фильтрат упаривают в роторном испарителе до 20% первоначального объема сыворотки крови, взятой в опыт. После упаривания проводят ультрафильтрацию через мембранные фильтры с молекулярной массой отсечения веществ 5 кД. Выход 150 мл с содержанием общего азота 2,17 мг/мл и аминного азота 0,88 мг/мл (табл. 1).

Субстанцию гидролизата получают добавлением 0,150 г консерванта нипагина к 150 мл фильтрата, смесь выдерживают при 50^oC, постоянно перемешивая, до полного растворения нипагина. После чего проводят стерильную фильтрацию на мембранных фильтрах с размером пор 0,22 мкм. Раствор препарата в стерильных асептических условиях разливают в ампулу объемом 1 10 мл. Ампулу запаивают.

Пример 2. Ферментативный гидролиз сыворотки крови телят проводят, как в примере 1. После окончания гидролиза смесь при перемешивании нагревают до температуры 852^oC и выдерживают 60 мин. Смесь охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через мембранные фильтры с диаметром пор 0,5 мкм. Затем проводят последовательную ультрафильтрацию фильтрата на мембранных установках с молекулярной массой отсечения веществ 100 кД и 5 кД. Полученный фильтрат упаривают в роторном испарителе до 20% первоначального объема сыворотки крови, взятой в опыт. После упаривания проводят ультрафильтрацию через мембранные фильтры с молекулярной массой отсечения 8 кД. Выход 165 мл с содержанием общего азота 2,50 мг/мл и аминного азота 0,92 мг/мл (табл. 1).

Субстанцию препарата получают, как в примере 1.

Биологическая активность полученных гидролизатов представлена в табл. 2.

Как видно из таблицы, добавление гидролизата и стандарта (солкосерила) к изолированным гепатоцитам приводит к активации потребления ими С₂, при этом полученный препарат обладал в 2 раза большей активностью по сравнению со стандартом солкосерила или на 70% выше активности препарата, полученного по способу-прототипу.

Заявляемый способ обеспечивает получение целевого продукта, не содержащего в своем составе белков (о чем свидетельствует отрицательная реакция с ТХУ), гемоглобина и продуктов его гидролиза (отрицательная реакция с О-толуидином) и характеризуется высокой биологической активностью и высоким выходом конечного продукта. Длительность процесса получения препарата составляет 10-12 ч.

Использованные источники информации

1. Патент СССР N 1748637, А 61 К 35/14, 1992.

2. РСТ N 89/06538, А 61 К 35/14, 1990.