способ клонального микроразмножения селекционного посадочного материала березы карельской

Формула изобретения

Способ клонального микроразмножения селекционного материала березы карельской, включающий получение проростков, их микрочеренкование, получение из микрочеренков побегов, размножение их, укоренение и адаптацию к нестерильным условиям среды растений-регенерантов, отличающийся тем, что в качестве экспланта используют проростки гибридных семян.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в леском хозяйстве для массового получения селекционного посадочного материала ценных древесных растений, в частности, березы карельской.

Береза карельская (Betula pendula Roth, var, carelica Mercl.) отличается высокодекоративной текстурой древесины, однако ареал естественного произрастания ограничен. Она относится к трудноразмножаемым растениям, поскольку при свободном опылении ее происходит расщепление признаков и в потомстве лишь небольшая часть его наследует признаки узорчатой текстуры древесины.

Использование контролируемого опыления с целью получения гибридных семян значительно повышает выход растений с признаками "карелистости" (до 80 и более) [1]

Однако контролируемое опыление достаточно трудоемкий процесс, сильно зависящий от климатических условий и биологических особенностей вида (цикличность цветения, низкая всхожесть гибридных семян и т. п.).

Известен способ микроклонального размножения карельской березы, включающий инкубирование межузловых стеблевых сегментов до образования на них сплошного слоя каллуса, который затем срезают и рекультивируют на свежей среде Мурасиге-Скуга с бензиламинопурином (БАП) 1 мг/л в контролируемых условиях (освещенность 3 4 клк в течение 24 ч при 25 26^oС) до формования адвентивных почек, которые при повторной пересадке культур формируются в побеги [2] Последние изолируют из каллуса, укореняют и доращивают на среде Буле без гормонов в тех же контролируемых условиях. Полученные регенеранты разрезают на микрочеренки с одной почкой и снова выращивают на той же среде. Процесс микрочеренкования повторяют несколько раз до получения необходимого количества растений, которые затем высаживают в горшочки с субстратом (торф и песок), доращивают в минитеплицах в течение 2 4 мес. С постепенным снижением влажности до естественной величины и переносят в пленочные теплицы для закаливания до конца вегетационного периода. Средний прирост к концу вегетационного периода составил 8,3 15,8 см.

Однако в указанном способе присутствует этап каллусообразования, который повышает вероятность самоклональной изменчивости исходного материала. При этом процесс получения посадочного материала достаточно длительный и составляет не менее 10 12 недь, средний прирост полученных растений довольно низкий (8,3 15,8 см).

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности является способ клонального микроразмножения гибридов карельской березы [3] Согласно указанному способу в качестве исходных эксплантов используют верхушечные и пазушные почки гибридов карельской березы, рост каллуса и формирование конгломерата микропобегов проводят на основной агаризованной питательной среды по Мурасиге и Скугу с добавками 80 120 мг/л лизина, 0,05 - 0,15 мг/л кинетина, 0,6 1,0 мг/л БАП, 0,05 0,08 мг/л нафтилуксусной кислоты (НУК) (среда 1), с последующим субкультивированием и удлинением побегов на основной агаризованной среде с уменьшенной вдвое концентрацией макросолей и сахарозы и с дополнением 0,4 0,6 мг/л БАП, 0,3 0,5 мг/л ИУК - (среда 2), укоренение растений проводят на основной жидкой питательной среде с дополнением 0,4-0,6 мг/л индолил-3-масляной кислоты (ИМК) и 0,1 0,3 мг/л НУК (среда 3). Культуры выращивают при освещении люминесцентными лампами (10 000 лк) на 16-часовом фотопериоде при 25^oС и относительной влажности воздуха 70 Укоренные растения-регенеранты высаживают в почву в теплицу с последующей высадкой в открытый грунт. Указанный способ позволяет в течение 10 11 нед получить посадочный материал, при этом приживаемость растений составляет в среднем 76

Недостатком указанного способа является присутствие этапа каллусообразования, что увеличивает вероятность самоклональной изменчивости. Кроме того, процесс получения посадочного материала достаточно длительный и требует большого количества дефицитных и дорогостоящих реактивов. При этом невысок процент приживаемости растений, инфицированность и гибель эксплантов (почек) составляет в среднем 16,4

Цель предлагаемого изобретения повышение выхода размножаемого селекционного материала, сокращение сроков его получения, а кроме того, повышение эффективности способа за счет упрощения и удешевления процесса получения посадочного материала.

Цель достигается тем, что в способе клонального микроразмножения селекционного посадочного материала березы карельской, включающем получение проростков, их микрочеренкование, получение из микрочеренков побегов, размножение их, укоренение и адаптацию к нестерильным условиям среды растений-регенерантов, согласно изобретению, в качестве экспланта используют проростки гибридных семян.

Анализ научно-технической и патентной литературы показал, что проростки гибридных семян березы карельской для клонального микроразмножения селекционного посадочного материала не использовались. Высокая эффективность процесса, его тиражируемость, высокая приживаемость, отсутствие инфицированности экспланта, определяют промышленную применимость предлагаемого способа. Расширяется биологическое разнообразие (в данном случае) исчезающего вида березы карельской, что имеет большое значение для селекции и практики лесного хозяйства.

По предлагаемому способу состава питательной среды имеет меньший набор компонентов, что, во-первых, удешевляет его, и во-вторых, делает более доступным. Преимуществом предлагаемого способа является и то, что побеги формируются непосредственно из ткани экспланта, минуя каллусообразование. Как известно, клетки каллуса недостаточно устойчивы, в них возможны мутационные процессы, что может повлиять на генотип потомства.

Способ осуществляют следующим образом.

Гибридные семена от скрещивания лучших форм березы карельской стерилизуют в ламинаре в течение 1 мин в 70-ном этаноле, а затем 15 мин в "Пероксе". По окончании стерилизации трижды промывают автоклавированной дистиллированной водой и укладывают в чашки Петри для проращивания на стерильную увлажненную фильтровальную бумагу. Затем, проростки, вытянувшиеся до 1,5 2,0 см разрезают на черенки и горизонтально помещают на питательную среду А (табл. 1), основой которой служит среда Мурасиге-Скуга. На свету через 3 4 нед образуются многочисленные побеги с молодыми листьями. Побеги быстро растут и удлиняются. На этой же среде проводят мультипликацию побегов, т.е. умножение их. Полученные побеги вновь черенкуют и горизонтально субкультивируют на свежую среду А. Указанный процесс повторяют многократно в зависимости от необходимости в объеме посадочного материала. Побеги, достигшие высоты 1,5 - 2,5 см с развитыми листочками, пересаживают на среду Б для корнеобразования (табл. 1). Образование и формирование корней на среде Б наблюдается в течение 10 14 дн.

Полученные растения-регенеранты, имеющие стебелек с листочками и корневую систему, высаживают в нестерильные условия сразу в теплицу с полиэтиленовым покрытием и капельным поливом.

В табл. 2 представлены показатели роста растений, высаженных в теплицу в июне-июле 1993 г.

Как показывают данные табл. 2, несмотря на неблагоприятное лето 1993 г. прирост растений-регенерантов, полученных по предлагаемому способу, превышает прирост по сравнению с аналогом в 2 раза.

Способ апробирован в опытно-производственных условиях. Получено и высажено более 3 тыс. растений-регенерантов.

Преимуществом предложенного способа по сравнению с известными является отсутствие этапа каллусообразования, что уменьшает вероятность самоклональной изменчивости. Кроме того, во времени процесс получения посадочного материала сокращается на 2 3 нед и составляет 7 9 нед, тогда как в известном способе для культивирования необходимо 10 11 недель.

В предложенном способе на отдельном черенке исходного материала образуется до 22 новых побегов, которые хорошо развиваются и в дальнейшем каждый из них дает полноценное растение.

Сравнение результатов укоренения in vitro показывает, что предлагаемый способ отличается упрощенным составом среды (экономятся дорогостоящие реактивы) и высоким процентом первичного укоренения (93 в предлагаемом, 69 в известном). Инфицирования и гибели регенерантов на этапах элонгации, мультипликации и укоренения не наблюдается. В предлагаемом способе приживаемость растений, высаженный в грунт, составила 83

Согласно проведенным экспериментом по предлагаемому способу клонального микроразмножения селекционного посадочного материала березы карельской в течение года можно получить более миллиона растений из одного семени.

Высокий коэффициент размножения, упрощенный и более доступный состав питательной среды позволяют использовать предлагаемый способ для решения производственных задач в лесном хозяйстве с целью выращивания ценного посадочного материала. Потомство может отличаться генетическим разнообразием, а это имеет большое положительное значение для селекционных целей и сохранения биологического разнообразия исчезающих растений.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Leena Ryynanen, Martti Ryynanen. Propagation of adult curlybirch. Succeeds with tussue culture.-Silva Fennika. 20. 1986, p.139-147.

2. Авторское свидетельство СССР N 1597386, МКИ5 C 12 N 5/00, 1990 г.

3. Авторское свидетельство СССР N 1752284, МКИ 5 A 01 H 4/00, 1992 г.