способ получения легочного сурфактанта

Формула изобретения

1. Способ получения легочного сурфактанта путем водно-солевой экстракции его из легкого крупного рогатого скота и последующего центрифугирования экстракта, отличающийся тем, что центрифугирование экстракта проводят при 150 g в течение 10 мин, полученный супернатант замораживают, затем оттаивают при температуре не выше 10^oC, полученную суспензию центрифугируют, осадок экстрагируют органическими растворителями, экстракт обрабатывают водно-солевыми растворами, после чего из него удаляют органические растворители до получения целевого продукта.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что центрифугирование суспензии, полученной после замораживания и оттаивания супернатанта, проводят при 3000

15000 g в течение 20-30 мин или проточно.

3. Способ по пп.1 и 2, отличающийся тем, что экстракцию полученного осадка проводят смесями хлороформа и метилового спирта в соотношениях 1 1 по Блайю и Дайеру или 2 1 по Фолчу.

4. Способ по пп.1-3, отличающийся тем, что в качестве водно-солевых растворов для обработки упомянутого экстракта используют 0,1%-ный раствор хлоридов натрия или калия в соотношении экстракт водно-солевой раствор 10 2 (об/об) по Фолчу или 10 4,5 (об/об) по Блайю или Дайеру.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к получению лекарственных препаратов из природного сырья, и может найти применение в промышленном производстве природных легочных сурфактантов.

Легочный сурфактант представляет собой природный комплекс веществ, состоящий из фосфолипидов, нейтральных липидов и сурфактант-ассоциированных белков. Он синтезируется в эпителиальных клетках легкого (альвеолоциты II типа) и эксткретируется ими на внутреннюю поверхность легких, создавая таким образом высокоспецифическую легочную "смазку". Сурфактант покрывает поверхность альвеолярного эпителия и, обладая способностью резко снижать поверхностное натяжение, предотвращает коллапс альвеол в конце выдоха.

Известно, что основной причиной синдрома дыхательных расстройств новорожденных, в особенности недоношенных, является недостаточность системы легочного сурфактанта. По этой причине до начала 90-х годов в развитых странах Запада умирало, а в России и в настоящее время погибает около половины недоношенных детей или около 15 20 тысяч детей ежегодно. Кроме того, у тех новорожденных с синдромом дыхательных расстройств, которые выживают, формируется бронхо-легочная дисплазия вследствие применения в их лечении искусственной вентиляции легких с использованием газовых смесей с высоким (более 60%) содержанием кислорода. Впоследствии эти дети страдают тяжелыми хроническими заболеваниями легких.

Легочный сурфактант является единственным и чрезвычайно эффективным средством профилактики и лечения синдрома дыхательных расстройств и бронхо-легочной дисплазии новорожденных детей.

Применение такого рода препаратов в последние годы в экономически развитых странах позволило резко (на 60 90%) снизить смертность недоношенных новорожденных. В нашей стране легочные сурфактанты не производятся и из-за их дороговизны не закупаются, а потому практически не используются.

В мировой медицинской практике применяют как синтетические и полусинтетические, так и природные легочные сурфактанты. Считают, что синтетические сурфактанты менее эффективны, хотя они безусловно более доступны. В то же время эти препараты в отличие от природных не содержат чрезвычайно важных для их свойств сурфактант-ассоциированных белков.

Предлагаемый нами способ относится к получению природных легочных сурфактантов, в частности сурфактантов из легких крупного рогатого скота.

Известен способ получения природного легочного сурфактанта из амниотической жидкости рожениц [1]

Способ заключается во взятии амниотической жидкости при проведении Кесарева сечения, ее центрифугировании при 150 g для удаления клеток, центрифугировании супернатанта при 7500 g для получения осадка, разделении ресуспендированного осадка в ступенсатом градиенте плотности сахарозы, трехкратного продавливания полученного из интерфазы материала через нейлоновую сетку с величиной пор 20 мкм с трехкратным переосаждением сурфактанта между этими продавливаниями и хранении полученного материала в замороженном состоянии.

Полученный этим способом препарат содержит 80,7% фосфолипидов, 9,4% нейтральных липидов и 5,4% белка.

Такой состав характерен для природного легочного сурфактанта. Наличие указанного количества белка в препарате свидетельствует о присутствии в нем как гидрофобных, так и гидрофильных сурфактант-ассоциированных белков. Эти белки существенны для проявления функциональных свойств легочного сурфактанта.

Вместе с тем отмечаемая авторами высокая вязкость препарата, вынуждающая авторов для ее уменьшения проводить трехкратное продавливание суспензии через нейлоновую сетку с диаметром пор 20 мкм свидетельствуют, как нами показано, о присутствии в препарате значительного количества ДНК (0,06 0,2 мг/мг фосфолипидов), что в настоящее время считается абсолютно недопустимым.

Как свидетельствует описание способа выделения сурфактакта из амниотической жидкости он трудоемок, сложен и длителен, содержит 6 процедур центрифугирования, 5 из них длительные (90 120 мин); способ нетехнологичен, получаемый по нему продукт чрезвычайно дорог и поэтому способ безусловно не может лечь в основу промышленного производства сурфактанта.

Наиболее близким к заявляемому и взятому в качестве прототипа является способ получения "Сурфактантного состава и фармацевтических композиций для использования в лечении синдрома дыхательных расстройств" (European patent 0 119 056 B1) [2]

Способ предназначен для получения полусинтетического легочного сурфактанта, который содержит как основные компоненты 1,2-дипальмитоил-глицеро-(3)-фосфохолин (65,4% ) важнейший фосфолипид природного легочного сурфактанта, пальмитиновую кислоту (8,7%) и липопротеин (природный липопротеин, выделенный из легкого крупного рогатого скота) в количестве 1,3% В качестве дополнительных компонентов используются различные синтетические фосфолипиды.

Способ состоит прежде всего в получении липопротеина из легкого крупного рогатого скота.

Для получения липопротеина легкое быка отмывают водой от крови и других загрязнений, разделяют на доли, удаляют сосуды, нарезают на тонкие куски и пропускают через мясорубку. К полученному гомогенату ткани добавляют физиологический раствор и перемешивают смесь при 4^oС в течение 100 мин. Гомогенат фильтруют под давлением и получают грубый экстракт.

Этот экстракт центрифугируют при 10000 об/мин, супернатант выбрасывают, а осадок ресуспензируют в физиологическом растворе и вновь центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин и осадок выбрасывают. Полученный супернатант центрифугируют снова при 10000 об/мин и собирают сырой осадок. Полученный таким образом неочищенный (грубый) осадок суспендируют в воде и к полученной суспензии добавляют хлорид натрия, таким образом чтобы достичь удельной плотности приблизительно 1,20, т.е. получают суспензию с концентрацией хлорида натрия около 30% Полученную суспензиют центрифугируют при 10000 об/мин при 0^oС в течение 50 мин, что приводит к разделению ее на три слоя. Верхний слой, представляющий собой пенистую эмульсию, собирают и суспендируют в дистиллированной воде. Полученную суспензию диализуют через целофановую мембрану против дистиллированной воды. После этого диализованную суспензию лиофилизируют и получают неочищенный (грубый) сухой продукт. К этому неочищенному продукту добавляют холодный этилацетат при 5^oС, полученную смесь перемешивают в течение 45 мин и фильтруют под остаточным давлением для отделения нерастворимого материала. Этот нерастворимый материал высушивают и добавляют к нему растворяющую смесь, состоящую из хлороформа и метанола (в объемном отношении 2:1). Полученную смесь встряхивают в течение 30 мин и фильтруют через бумажный фильтр для получения фильтрата. Отфильтрованный осадок экстрагируют еще раз той же смесью растворителей и тем же объемом и фильтруют для получения вторичного экстракта. Эту процедуру повторяют еще раз. Три полученных экстракта объединяют и высушивают досуха под остаточным давлением до получения твердого остатка.

Этот материал растворяют в смеси хлороформа и метанола (2:1 об/об), хроматографируют на колонке Сефадекса LH-20 (колонка 15,5 см в диаметре и 90 см длиной), уравновешенной той же смесью растворителей, и элюируют той же смесью со скоростью 5 мл/мин. В процессе элюации собирают материал, выходящий в свободном объеме колонки.

Полученный фильтрат при микробиологическом контроле стерилен и дальнейшие процедуры с ним выполняли в стерильных условиях. Его высушивали досуха под остаточным давлением и суспендировали в стерильной воде. Суспензию лиофилизировали и получили липопротеин в виде светло-желтого с коричневым оттенком порошка.

Всего из 128,3 кг ткани легкого было получено 8,3 г липопротеина.

Анализ показал, что он имеет м.м. 34.000 кДа и содержит 62,1% (в/в) фосфолипидов, 31,3 белка, 4,6% воды и 2,0% неидентифицированных компонентов.

Для получения препарата сурфактанта брали 0,13 г липопротеина, полученного этим способом, и добавляли 6,58 г стерильного 1,2-дмпальмитоилглицеро-(3)-фосфохолина (ДППС), 2,19 г 1,2-диацил-sn-глицеро-(3)-фосфо-sn-глицерина (ДФГ) (с длиной жирнокислотных остатков от 14 до 24 углеродных атомов), 1,10 г пальмитиновой кислоты (ПК) и для растворения этих компонентов использовали 10,0 л смеси хлороформа и метанола (2:1, об/об) при комнатной температуре. Смесь выпаривали досуха при остаточном давлении и остаток ресуспендировали в водно-этанольной смеси (9: 1, об/об) при 45^oС в течение 20 мин. Суспензию замораживали при -40^oС и высушивали под вакуумом 75 90 мм Hg в течение 24 ч.

Получено 10,33 г сурфактанта в виде белого порошка, содержащего 63,7% ДППС, 21,2% ДФГ, 10,6% ПК, 1,3% липопротеина и 3,2% воды (все величины выражены в соотношении в/в).

Такой состав препарата имеет определенное сходство с природным легочным сурфактантом прежде всего по содержанию основного фосфолипида природных легочных сурфактантов ДППС. В отношении присутствующего в препарате белка следует отметить, что его всего около 0,4% (т.к. липопротеин содержит около 30% белка), тогда как в природном легочном сурфактанте только гидрофобных белков с м. м. 5 8 кДа более 1% Эти белки чрезвычайно важны для проявления функции этих препаратов. Большое значение для проявления функции сурфактанта имеют и другие имеющиеся в природном сурфактанте фосфолипиды (фосфатидилглицерины, фосфатидилсерины, дифофсфатидилглицерины, фосфатидилэтаноламины). В разных вариантах препарате по прототипу присутствует наряду с ДППС, как показано авторами, только какой-нибудь один из этих фосфолипидов. Малое содержание сурфактант-ассоциированных белков и неполный спектр фосфолипидов в этих препаратах не позволяет воспроизвести интегральную структуру сурфактанта полностью.

Природные же препараты сурфактантов, помимо указанных компонентов, содержат также все гидрофобные (м.м. 5 8 кДа, 18 кДа) сурфактант-ассоциированные белки существенные для проявления их функции и отсутствующие в прототипе.

Функциональную оценку сурфактанта, полученного по прототипу авторы проводили на зрелых кроликах, страдающих септицемией, вызванной внутрибрюшинным введением культуры клеток патогенного штамма Е.coli, осложняющейся в дальнейшем развитием синдрома дыхательных расстройств (СДР). Испытания показали, что такой тип СДР купируются в половине случаев и без применения сурфактанта только использованием канамицина (антибиотика широкого спектра действия). Сочетанное введение канамицина и сурфактанта купирует СДР у 85% больных животных, а применение одного сурфактанта без канамицина купирует СДР только у половины животных.

Во всех случаях сурфактант вводили от 1 до 6 раз в дозе 50 100 мг/кг массы животного на каждое введение, а канамицин вводили от 80 до 150 мг/кг в виде 2 8 раздельных доз. Канамицин вводили в течение 24 ч до и после развития СДР.

Как свидетельствует описание способа выделения липопотеина, необходимого для получения сурфактанта по прототипу, он чрезвычайно трудоемок, чрезвычайно сложен, многостадиен и дает очень малый выход искомого липопротеина. Последний составляет в конечном препарате лишь 1,3% по массе, а остальная часть представляет собой синтетические фосфолипиды. Способ по прототипу включает 25 стадий, из которых 4 центрифугирования, одно из которых в градиенте плотности, длительный последующий после градиента диализ, обработку этилацетатом, длительную гель-фильтрацию с применением дорогостоящего носителя Сефадекса LH-20 для отделения липопротеина от основной массы сурфактантных фосфолипидов и белков.

Технический результат изобретения состоит в упрощении способа получения сурфактанта и улучшении его качества.

Этот результат достигается тем, что в известном способе получения легочного сурфактанта путем водно-солевой экстракции его из легкого крупного рогатого скота и последующего центрифугирования экстракта (или смыва сурфактанта легкого, полученного путем бронхо-альвеолярного лаважа) центрифугирование проводят при 150 g в течение 10 мин, полученный при центрифугировании супернатант замораживают, затем оттаивают при температуре не выше +10^oС, после чего суспензию центрифугируют, полученный осадок экстрагируют органическими растворителями, экстракт обрабатывают водно-солевыми растворами, после чего из него удаляют органические растворители до получения целевого продукта.

Целесообразно центрифугирование суспензии, полученной после замораживания и оттаивания супернатанта, проводить при 3000 15000 g в течение 20 30 мин или проточно, экстракцию полученного осадка проводить смесями хлороформа и метилового спирта в соотношениях 2:1 (об/об) по Фолчу [3] или 1:1 по Блайю и Дайеру [4] а в качестве водно-солевых растворов использовать 0,1% раствор хлоридов натрия или калия в соотношениях экстракт:водно-солевой раствор 10:2 (об/об) при экстракции липидов по Фолчу или 10:4,5 (об/об) при экстракции по Блайю и Дайеру.

Центрифугирование водно-солевого экстракта при 150 g в течение 10 мин позволяет убрать из него остатки обрывков тканей и клеток, оставив сурфактант в супернатанте. Это безусловно улучшает качество препарата, поскольку в него не попадает тканевой и клеточный материал.

Низкое содержание сурфактанта в получаемом супернатанте привело нас к необходимости работать с большими объемами жидкости и поставило перед нами задачу накопления и хранения ее в течение некоторого времени. В качестве способа хранения мы выбрали замораживание супернатанта, а при последующем оттаивании его мы обнаружили наличие в нем выраженного хлопьевидного осадка. Удалив его низкоскоростным центрифугированием, мы обнаружили практически полное отсутствие материала сурфактанта в полученном супернатанте. Анализ же самого осадка выявил, что он более чем на 90% представляет собой легочный сурфактант.

Этот неожиданный для нас факт позволил нам избежать многочисленных трудоемких и длительных процедур выделения липопротеина, включающего многократное дифференциальное и плотностное центрифугирование, диализ, трудоемкую гель-фильтрацию на гидрофобном Сефадексе LH-20, ведущих к удалению основной массы фосфолипидов и белков легочного сурфактанта.

Устранение этих процедур позволило значительно упростить способ получения конечного продукта. Такое упрощение способа сделало его высокотехнологичным и пригодным для использования в промышленном производстве.

Кроме того, обнаруженные нами условия агрегации сурфактанта, а именно замораживание и последующее оттаивание супернатанта при температуре не выше +10^oС, обеспечивают в таких мягких условиях выделения сохранность в конечном продукте полного набора фосфолипидов и нейтральных липидов сурфактанта, сохраняют значительное количество (около 2% по отношению к фосфолипидам) гидрофобных сурфактант-ассоциированных белков в их естественном липидном окружении. Это безусловно значительно повышает качество конечного продукта, выражающееся в значительно более высоком терапевтическом эффекте получаемого сурфактанта, и позволяет избежать добавления в конечные препараты дорогих синтетических фосфолипидов, составляющих основу полусинтетических известных сурфактантов.

Экстрагирование органическими растворителями полученного центрифугированием осадка и последующая обработка экстракта водно-солевыми растворами создают условия перехода оставшихся в осадке балластных белков и ДНК в водную фазу, что освобождает экстракт с целевым продуктом от примесей и в еще большей степени повышает его качество. Причем предлагаемые нами смеси органических растворителей с экстракцей по Фолчу (хлороформ:метанол 2:1) (об/об) или по Блайю и Дайеру (хлороформ-метанол 1:1) (об/об), обеспечивая высокое качество искомого продукта, наиболее доступны, что является решающим для использования способа в промышленном производстве.

Использование водно-солевых растворов в виде 0,1% растворов хлорида натрия или калия в указанных соотношениях, как нами показано, позволяет исключить потери фосфолипидов сурфактанта и удалять нелипидные примеси из искомого продукта, что обеспечивает его высокое качество.

Пример 1. 10 кг легкого быка отмывают холодной водой от крови, освобождают от крупных бронхов и сосудов, разрезают на куски около 0,5 кг и пропускают через ножевую мясорубку, добавляют к измельченным легким 50 л холодного +4^oC физиологического раствора (ФР, 0,9% раствора хлорида натрия) и перемешивают при +4^oС в течение 15 мин. Гомогенат фильтруют через марлю, осадок выбрасывают, а фильтрат центрифугируют при 150 g в течение 10 мин для удаления остатков ткани и клеток. Полученный супернатат (51 л) замораживают при -20^oС в течение 60 мин, после чего оттаивают при температуре +4^oС. Полученную суспензию центрифугируют при 3000 g на проточной центрифуге в течение 30 мин при +4^oС.

Полученный осадок (12 г) экстрагируют по Блайю и Дайеру. Для этого его ресуспендируют в 240 мл дистиллированной воды, добавляют 900 мл смеси из 300 мл хлороформа и 600 мл метанола и перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре в атмосфере аргона. После этого добавляют 300 мл хлороформа и 300 мл 0,18% раствора хлорида калия (т.е. соблюдаются соотношения хлороформа и метанола 1:1, экстракция по Блайю и Дайеру, и соотношение объема экстракта и 0,1% водно-солевого раствора 10:4,5). Суспензию перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре в атмосфере аргона и центрифугируют при 600 g в течение 20 мин. Из образовавшейся двуфазной системы верхнюю фазу отбрасывают, а нижнюю отбирают и удаляют из нее органические растворители при остаточном давлении на ротационном испарителе RVO-64 при температуре 37^oС. Сухой остаток ресуспендируют в 200 мл дистиллированной воды и лиофилизируют.

Получено 10 г белого с кремоватым оттенком цвета аморфного порошка.

Результаты анализа,г:

фосфолипиды 8,9

нейтральные липиды 0,9

белок 0,2

Анализ продукта на содержание липидного фосфора проводился по Васьковскому [4] содержание белка определяли по методу Лоури после делипидизации материала хроматографией в тонком слое силикагеля. Анализ спектра белков с помощью электрофореза в ПАГ в присутствии мочевины и додецилсульфата натрия [5] выявил группы белков с м.м. 18 кДа и 5 8 кДа (рис.1). Эти гидрофобные белки специфичны для природного легочного сурфактанта. Других белков не обнаружено. Анализ на содержание ДНК по Бартону [6] отрицательный.

Подлинность препарата подтверждена

положительным пенным тестом;

исследованием фосфолипидного состава с помощью двумерной тонкослойной хроматографии на силикагеле в системах: хлороформ-метанол-7N NH₃ (65:25:5) и хлороформ-ацетон-метанол-уксусная кислота вода (30:40:10:10:5) (рис.2). На хроматограмме видно, что в препарате все основные классы фосфолипидов, свойственные природному сурфактанту. В то время как, в прототипе, как описывают авторы, присутствуют только фосфатидилхолин и один из других фосфолипидов сурфактанта в зависимости от варианта препарата.

исследованием терапевтической активности.

После однократного интратрахеального введения собакам с моделью сурфактант-дефицитного синдрома дыхательных расстройств полученного препарата в дозе 50 100 мг/кг массы уже через 15 мин обнаружено увеличение парциального напряжения кислорода в артериальной крови и насыщения гемоглобина кислородом, а также снижение парциального напряжения углекислого газа в артериальной крови. Через сутки после введения препарата у собак не было одышки, были нормальные параметры газов крови и отсутствовали патологические изменения на рентгенограммах грудной клетки (нормальная воздушность легких без ателектазов), а их поведение и состояние не отличалось от здоровых. Собачки с той же моделью синдрома дыхательных расстройств, не получавшие препарата, характеризовались одышкой при нагрузке в течение 3 суток, наличием сливных ателектазов в легких на рентгенограммах грудной клетки и восстановлением всех параметров только к 7 8 суткам после развития синдрома дыхательных расстройств. Ни в одном случае при лечении 10 собак не было гибели животных.

Как свидетельствуют выше приведенные характеристики полученного препарата сурфактанта, он значительно лучшего качества в сравнении с прототипом, поскольку соответствует составу природного легочного сурфактанта и обладает более высоким терапевтическим эффектом.

Пример 2. 10 легких (20 кг) двухгодовалых бычков выделяли из грудной клетки, избегая их повреждения, отмывали от крови и заполняли через трахею 10 л физиологического раствора каждое легкое. Трахею закрывали пробкой и легкие медленно встряхивали на станине в одной плоскости в течение 15 мин. Жидкость бронхоальвеолярного лаважа сливали и отжимали легкие снаружи механически для более полного выдавливания жидкости из легких. Всего получено 82 л суспензии. Ее центрифугировали при 150 g в течение 10 мин и осадок клеток выбрасывали. Полученный супернатат (81 л) замораживали при -20^oС в течение 60 мин, после чего оттаивали при +10^oС. Полученную суспензию центрифугировали при 15000 g на проточной центрифуге ОТР 102К-01 в течение 45 мин при +4^oC.

Полученный осадок (18 г) экстрагировали по Фолчу. Для этого его ресуспендировали в 1,0 л дистиллированной воды, добавляли 20 л смеси из 13,3 л хлороформа и 6,7 л метанола (соотношение хлороформа и метанола 2:1), суспензию перемешивали в течение 1 ч в атмосфере аргона и добавляли 3,0 л стерильного 0,13% водного раствора хлорида натрия (соотношение объема экстракта и водного раствора хлорида натрия 10:2). Суспензию перемешивали в течение 30 мин в атмосфере аргона и центрифугировали при 600 g в течение 30 мин. Из полученной двуфазной системы верхнюю фазу отбрасывали, а нижнюю забирали и фильтровали через капроновый фильтр с величиной пор 0,2 мкм (стерилизующее фильтрование). Полученный фильтрат упаривали досуха на ротационном испарителе под остаточным давлением при +35^oС. Остаток ресуспендировали в 800 мл стерильной дистиллированной воды, эмульсию разливали в стерильные флаконы по 5 мл и лиофилизировали. Флаконы укупоривали резиновыми пробками в атмосфере аргона и завальцовывали алюминиевыми колпачками.

Получено 160 флаконов по 100 мг белого с кремоватым оттенком аморфного порошка в каждом (всего 16 г сурфактанта)

Результаты анализа (одного флакона),мг:

фосфолипиды 89,0

нейтральные липиды 9,0

белок 2,0

Подлинность и специфические свойства на модели сурфактант-дефицитного синдрома дыхательных расстройств подтверждены как и в примере 1.

Предлагаемый способ получения легочного сурфактанта по сравнению с известным имеет ряд существенных преимуществ.

1. Способ значительно проще прототипа, поскольку включает всего 5 достаточно простых операций против 25 трудоемких и длительных процедур в прототипе.

2. Способ обеспечивает получение высокоочищенного препарата, содержащего все присущие сурфактанту фосфолипиды и существенное количество (около 2%) сурфактант-ассоциированных гидрофобных белков в их собственном липидном окружении, в то время как в прототипе присутствуют только два основных фосфолипида и около 0,4% белка из-за многостадийной обработкой исходного сырья, которая приводит к получению липопротеина, что вынуждает для получения препаратов сурфактанта добавлять к нему синтетические фосфолипиды.

3. Небольшое количество стадий получения сурфактанта делает заявляемый способ высокотехнологичным и применимым в промышленном производстве.

Способ разработан в лаборатории биотехнологии препаратов для лучевой диагностики и терапии Центрального научно-исследовательского рентгено-радиологического института Минздравмедпрома РФ совместно с ТОО "Контраст, ЛТД".

Препарат в настоящее время проходит доклинические испытания и планируется представить материалы по этому препарату в Фармкомитет Минздравмедпрома в 1996 году.

Предлагаемый способ положен в основу создаваемого в настоящее время промышленного производства природного легочного сурфактанта в ЦНИРРИ Минздравмедпрома.