способ получения легочного сурфактанта

Формула изобретения

1. Способ получения легочного сурфактанта путем взятия амниотической жидкости и центрифугирования ее при 150g в течение 10 мин, отличающийся тем, что амниотическую жидкость берут в родах, полученный при ее центрифугировании супернатант замораживают, затем оттаивают при температуре не выше 10^oC, после чего суспензию центрифугируют, полученный осадок экстрагируют органическими растворителями, экстракт обрабатывают водно-солевыми растворами, после чего из него удаляют органические растворители до получения целевого продукта.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что центрифугирование суспензии, полученной после замораживания и оттаивания супернатанта, проводят при 3000-15000 g в течение 20-30 мин или проточно.

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что экстракцию полученного осадка проводят смесями хлороформа и метилового спирта в соотношениях 1:1 по Блайю и Дайеру или 2:1 по Фолчу.

4. Способ по пп. 1 3, отличающийся тем, что в качестве водно-солевых растворов используют 0,1%-ный раствор хлоридов натрия или калия в соотношениях экстракт водно-солевой раствор 10 2 (об/об) при экстракции по Фолчу или 10 4,5 при экстракции по Блайю и Дайеру.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к получению лекарственных препаратов, и может найти применение в промышленном производстве природных легочных сурфактантов.

Легочный сурфактант представляет собой природный комплекс веществ, состоящий из фосфолипидов, нейтральных липидов и сурфактант-ассоциированных белков. Он синтезируется в эпителиальных клетках легкого (альвеолоциты II типа) и экстретируется ими на внутреннюю поверхность легких, создавая таким образом высокоспецифическую легочную "смазку". Сурфактант покрывает поверхность альвеолярного эпителия и, обладая способностью резко снижать поверхностное натяжение, предотвращает коллапс альвеол в конце выдоха.

Известно, что основной причиной синдрома дыхательных pасстройств новорожденных, в особенности недоношенных, является недостаточность системы легочного сурфактанта. По этой причине до начала 90-х годов в развитых странах Запада умирало, а в России и в настоящее время погибает около половины недоношенных детей или около 15 20 тысяч детей ежегодно. Кроме того, те новорожденные, которые выживают после развития у них синдрома дыхательных расстройств, из-за применения в их лечении искусственной вентиляции легких с использованием газовых смесей с высоким (более 60%) содержанием кислорода впоследствии страдают тяжелыми хроническими заболеваниями легких, причиной которых является бронхо-легочная дисплазия.

Легочный сурфактант является единственным и чрезвычайно эффективным средством профилактики и лечения синдрома дыхательных расстройств и бронхо-легочной дисплазии новорожденных детей.

Применение такого рода препаратов в последние годы в экономически развитых странах позволило резко (на 60 90%) снизить смертность недоношенных новорожденных. В нашей стране легочные сурфактанты не производятся и из-за дороговизны не закупаются, а потому практически не используются.

В мировой медицинской практике применяют как синтетические и полусинтетические, так и природные легочные сурфактанты. Считают, что синтетические сурфактанты менее эффективны, хотя они безусловно более доступны. В то же время эти препараты в отличие от природных не содержат чрезвычайно важных для их свойств сурфактант-ассоциированных белков.

Предлагаемый способ относится к получению природного легочного сурфактанта, в частности сурфактанта человека.

Наиболее близким к нему является способ получения легочного сурфактанта из амниотической жидкости рожениц [1] взятый в качестве прототипа. Эта работа является единственной, посвященной получению легочного сурфактанта человека из амниотической жидкости рожениц.

Способ заключается во взятии амниотической жидкости при проведении Кесарева сечения. Жидкость центрифугируют при 150 g в течение 10 мин, а полученный супернатант подвергают центрифугированию при 7500 g в течение 90 мин. Осадок ресуспендируют в физиологическом растворе, наносят на ступенчатый градиент 0,55 0,27 М сахарозы в 0,15 М хлориде натрия и центрифугируют при 1000000 g в течение 90 мин. Интерфазу, расположенную между двумя сахарозными слоями, забиpают, продавливают через нейлоновый фильтр с диаметром пор 20 мкм и разводят дистиллированной водой. Сурфактант осаждают центрифугированием при 7500 g в течение 120 мин и из-за его очень высокой вязкости продавливают ресуспендированный материал через тот же фильтp еще раз и снова центрифугируют. С осадком процедуру повторяют еще раз.

Полученный этим способом препарат содержит 80,7% фосфолипидов, 9,4% нейтральных липидов и 5,4% белка.

Такой состав характерен для природного легочного сурфактанта. Наличие указанного количества белка свидетельствует о присутствии в нем как гидрофобных, так и гидрофильных сурфактант-ассоциированных белков. Эти белки существенны для проявления функциональных свойств легочного сурфактанта.

Вместе с тем, высокая вязкость препарата, вынуждающая авторов для ее уменьшения проводить трехкратное продавление суспензии через нейлоновый фильтр с диаметром пор 20 мкм, свидетельствует, как нами показано, о присутствии в препарате значительного количества ДНК (0,06 0,2 мг/мг фосфолипидов), что в настоящее время считается абсолютно недопустимым.

Как свидетельствует описание способа выделения сурфактанта по прототипу, он чрезвычайно трудоемок, сложен и длителен. Шесть процедур центрифугирования, причем 5 из них длительного (90 120 мин), в том числе ультрацентрифугирование, а также многократное переосаждение с упомянутым промежуточным продавливанием через фильтры для снижения вязкости продукта делают способ нетехнологичным, а продукт чрезвычайно дорогим. Такой способ безусловно не может лечь в основу промышленного производства сурфактанта. Следует еще раз подчеркнуть, что получаемый при этом продукт содержит ДНК.

Технический результат изобретения состоит в упрощении способа получения сурфактанта и улучшении его качества.

Этот результат достигается тем, что в известном способе получения легочного сурфактанта путем взятия амниотической жидкости и центрифугировании ее при 150 g в течение 10 мин амниотическую жидкость берут в родах, полученный при ее центрифугировании супернатант замораживают, затем оттаивают при температуре не выше +10^o С, после чего суспензию центрифугируют, полученный осадок экстрагируют органическими растворителями, экстракт обрабатывают водно-солевыми растворами, после чего из него удаляют органические растворители до получения целевого продукта.

Целесообразно центрифугирование суспензии, полученной после замоpаживания и оттаивания супернатанта, проводить при 3000 15000 g в течение 20 30 мин или проточно, экстракцию полученного осадка проводить смесями хлороформа и метилового спирта в соотношениях 2:1 (об/об) по Фолчу [2] или 1:1 по Блайю и Дайеру [3] а в качестве водно-солевых растворов использовать 0,1% раствор хлоридов натрия или калия в соотношениях экстракт:водно-солевой раствор 10:2 (об/об) при экстракции по Фолчу или 10:4,5 при экстракции по Блайю и Дайеру.

Использование для получения сурфактанта амниотической жидкости, взятой в родах, значительно упрощает получение исходного сырья и делает его доступным.

Получение таким способом большого количества амниотической жидкости поставило перед нами задачу ее хранения. Для этой цели мы использовали замораживание. При оттаивании мы заметили появление хлопьевидного осадка. Отделив его центрифугированием, мы обнаружили, что в супернатанте содержатся лишь следы сурфактанта. Это побудило нас исследовать осадок и оказалось, что он представляет собой более чем на 90% легочный сурфактант. Этот неожиданный факт позволил избежать трудоемких и длительных процедур выделения искомого продукта, включая ультрацентрифугирование, применяемых для этих целей в известном способе и ранее нами.

Как известно, ультрацентрифугирование, например, позволяет одновременно обрабатывать не более 1 1,5 л жидкости в течение часа. Обнаруженная агрегация сурфактанта позволила нам впервые использовать для его выделения низкоскоростное центрифугирование, а практически полное осаждение сурфактанта в этих условиях и отсутствие его в супернатате позволило использовать проточное центрифугирование со скоростью обработки амниотической жидкости до 10 л в час. Это привело к значительному упрощению способа, сделало его высокотехнологичным и при предложенном источнике сырья сделало способ пригодным для использования его в промышленном производстве.

Кроме того, обнаруженные нами условия агрегации сурфактанта, а именно замораживание и последующее оттаивание супернатанта при температуре не выше +10^oС, обеспечивают в таких мягких условиях сохранность его природных свойств, а возможность использования низкоскоростного центрифугирования приводит, несомненно, к значительно меньшему соосаждению вместе с сурфактантом балластных белков, что улучшает качество конечного продукта.

Экстрагирование органическими растворителями полученного центрифугированием осадка и последующая обработка экстракта водно-солевыми растворами создают условия перехода оставшихся в осадке балластных белков и ДНК в водную фазу, что освобождает экстракт с целевым продуктом от примесей и в еще большей степени повышает его качество. Причем предлагаемые нами смеси органических растворителей с экстракцией по Фолчу (хлороформ: метанол 2:1) (об/об) или по Блайю и Дайеру (хлороформ:метанол 1:1) (об/об), обеспечивая высокое качество искомого продукта, наиболее доступны, что также является важным для использования способа в промышленном производстве.

Использование водно-солевых растворов в виде 0,1% растворов хлорида натрия или калия в указанных соотношениях, как нами показано, позволяет исключить потери фосфолипидов сурфактанта и удалять нелипидные примеси из искомого продукта, что обеспечивает его высокое качество.

Пример 1. Роженице по строгим акушерским показаниям производят вскрытие околоплодного пузыря, в который вводят полиэтиленовый стерильный катетер и через него забирают амниотическую жидкость. Первые 10 мл амниотической жидкости выбрасывают, последующие 500 мл собирают в стерильную посуду и центрифугируют при 150 g в течение 10 мин. Полученный супернатант замораживают при -20^oС в течение 60 мин, после чего оттаивают при 4^oС. Полученную суспензию центрифугируют при 3000 g в течение 20 мин на центрифуге РС-6 при +4^oC. Полученный осадок экстрагируют по Блайю и Дайеру [3] Для этого его ресуспендируют в 20 мл дистиллированной воды, добавляют 75 мл смеси из 25 мл хлороформа и 50 мл метанола и перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого добавляют 25 мл хлороформа и 25 мл 0,18% раствора хлорида калия (т.е. конечное соотношение в смеси хлороформа и метанола составляло 1: 1 соотношение объема экстракта и 0,1% раствора хлорида калия 10: 4,5). Суспензию перемешивают в течение 30 мин при комнатной температуре и центрифугируют при 600 g в течение 20 мин. Из образовавшейся двуфазной системы верхнюю фазу отбрасывают, а нижнюю отбирают и удаляют из нее органические растворители под вакуумом на ротационном испарителе RVO-64 при температуре 37^oС. Сухой остаток ресуспендируют в 20 мл дистиллированной воды и лиофилизируют.

Получено 50 мг белого с кремоватым оттенком цвета аморфного порошка.

Результаты анализа:

Фосфолипиды 46,9 мг

Нейтральные липиды 2,1 мг

Белок 1,0 мг

Анализ продукта на содержание липидного фосфора проводился по Васьковскому [4] содержание белка определяли по методу Лоури после делипидизации материала хроматографией в тонком слое силикагеля. Анализ спектра белков с помощью электрофореза в ПАГ в присутствии мочевины и додецилсульфата натрия [5] выявил группы белков с м.м. 18 кДа и 5 8 кДа. Эти гидрофильные белки специфичны для природного легочного сурфактанта. Других белков не обнаружено. Анализ на содержание ДНК по Бартону [6] отрицательный.

Подлинность препарата подтверждена по ВФС Положительным пенным тестом, а также исследованием фосфолипидного состава с помощью двумерной тонкослойной хроматографии на силикагеле в системах: хлороформ метанол 7N NH₃ (65:25:5) и хлороформ ацетон метанолуксусная кислота вода (30:40:10:10:5). Содержание отдельных классов фосфолипидов препарата белка и ДНК представлено в табл.1 в сравнении с прототипом [1]

Как видно из таблицы, в отличие от прототипа, полученный препарат сурфактанта лучшего качества, а именно в нем отсутствует ДНК, он содержит значительно меньше белка (2,0 против 5,4), причем это только гидрофобные сурфактант-ассоциированные белки, необходимые для проявления его функции. Анализ содержания отдельных классов фосфолипидов показывает сходство с прототипом и соответствует составу легочного сурфактанта человека.

Подлинность препарата подтверждена также исследованием терапевтической активности.

После интратрахеального введения собакам с моделью сурфактант-дефицитного синдрома дыхательных расстройств полученного препарата в дозе 15 мг/кг массы уже через 15 мин после введения обнаружено увеличение парциального напряжения кислорода в артериальной крови и насыщения гемоглобина кислородом, а также снижение парциального напряжения углекислого газа в артериальной крови. Через сутки после введения препарата у собак не было одышки, были нормальные параметры газов крови и отсутствовали патологические изменения на рентгенограммах грудной клетки (нормальная воздушность легких без ателектазов), а их поведение и состояние не отличалось от здоровых. Собаки с той же моделью синдрома дыхательных расстройств, не получавшие препарата, характеризовалась одышкой при нагрузке в течение 3 суток, наличием сливных ателектазов в легких на рентгенограммах грудной клетки и восстановлением всех параметров только к 7 8 суткам после развития синдрома дыхательных расстройств.

Пример 2. Амниотическую жидкость берут у рожениц, как в примере 1.

30 л амниотической жидкости центрифугируют при 150 g в течение 10 мин. Супернатант (29,9 л) замораживают при -20^oС и через 3 ч оттаивают при -10^oС. Суспензию центрифугируют при 15000 g на проточной центрифуге (3 ч). Осадок (3,5 г) экстрагируют по Фолчу [2] Для этого его ресуспендируют в 0,5 л дистиллированной воды, добавляют 10 л смеси из 6,65 л хлороформа и 3,35 л метанола, суспензию перемешивают в течение 1 ч и добавляют 1,5 л стерильного 0,13% водного раствора хлорида натрия (т.е. конечное соотношение хлороформа и метанола составляет 2:1, а соотношение объема экстракта и водного раствора хлорида натрия 10:2). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 600 g в течение 30 мин. Из полученной двуфазной системы верхнюю отбрасывают, а нижнюю забирают и фильтруют через капроновый фильтр с величиной пор 0,2 мкм (стерилизующее фильтрование). Полученный фильтрат упаривают досуха на ротационном испарителе под вакуумом при +35^oС. Остаток ресуспендируют в 600 мл стерильной дистиллированной воды, эмульсию разливают в стерильные флаконы по 5 мл и лиофилизируют. Флаконы упаривают в атмосфере аргона.

Получено 120 флаконов по 25 мг белого с кремоватым оттенком аморфного порошка в каждом (всего 3 г сурфактанта)

Результаты анализа (одного флакона),мг:

фосфолипиды 23,4

нейтральные липиды 1,1

белок 0,5

Подлинность и специфические свойства на модели сурфактант-дефицитного синдрома дыхательных расстройств подтверждены как и в примере 1.

Предлагаемый способ получения легочного сурфактанта по сравнению с известным имеет ряд существенным преимуществ.

1. В отличие от прототипа способ значительно проще, так как включает всего 5 достаточно простых операций, выполнимых в течение одного рабочего дня; он доступнее, так как основан на получении амниотической жидкости в родах. Все это делает его применимым в промышленном производстве.

2. Способ обеспечивает получение препарата более высокого качества, не содержащего балластных белков и ДНК за счет дополнительной очистки сурфактанта.

Способ разработан в лаборатории биотехнологии препаратов для лучевой диагностики и терапии Центрального научно-исследовательского рентгено-радиологического института Минздравмедпрома РФ совместно с ТОО "Контраст, ЛТД".

Препарат прошел доклинические испытания и 29 декабря 1994 года представлен в Фармакологический и Фармакопейный комитеты Минздравмедпрома для получения разрешения на клинические испытания.

Предлагаемый способ положен в основу разрабатываемого в настоящее время регламента промышленного производства природного легочного сурфактанта.